新生兒黃疸G6PD基因突變及實驗室相關指標分析

王楊 吉永 匡野 付曉野 楊曉青 李祎

新生兒黃疸（neonatal jaundice）在新生兒中十分常見。有文獻研究表明，其發病率達0.35%～0.57%以上［1］，見于80%以上早產兒和60%以上足月兒，占住院新生兒的20%～40%［2］。由于新生兒早期膽紅素的代謝特點、疾病因素，新生兒黃疸可以是預后良好的暫時生理現象，也可以是預后較差的疾病表現。

如果未及時發現和治療血清中升高的膽紅素，可能在下列幾個方面影響到新生兒的遠期臨床預后：一、黃疸可能發導致智力發育低下、癡呆以及大腦發育障礙；持續的黃疸還可能使患兒發生膽紅素腦病或核黃疸，給患兒大腦造成不可逆的神經系統損害。二、一些嚴重的黃疸，如溶血性黃疸還會損傷肝腎功能，使患兒多器官衰竭［3］。因此研究能夠有效輔助臨床早期診斷和治療新生兒黃疸的實驗室相關指標顯得尤為重要。而遺傳因素對新生兒黃疸的發生起著十分重要的作用，G6PD基因突變即是其中一種。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年8月至2019年3月昆明市延安醫院新生兒黃疸患兒134 例，男性91 例，女性43 例，日齡2 h 至28 天。其中91 例患兒為病理性黃疸，占67.91%，43 例患兒為生理性黃疸，占32.09%。納入標準：符合《兒科學》［4］中的診斷標準：①出生后24 h 內即出現黃疸，持續時間長，足月兒＞2 周，早產兒＞4 周仍不退；②血清總膽紅素足月兒超過220 μmol/L，早產兒超過257 μmol/L；③每日血清膽紅素升高超過5 mg/dL 或每小時＞0.5 mg/dL；④結合膽紅素超過34 μmol/L。排除標準為入院時合并以下疾病或情況的患兒：早產、過期產、溶血病、感染、顱內出血及巨大頭顱血腫、新生兒出血癥、先天畸形（消化道畸形、先天性心臟?。⒓谞钕俟δ艿拖隆⑻剖暇C合征、紅細胞增多癥、出生窒息、缺氧缺血性腦病、肝功能異常及直接膽紅素升高。從134 例患兒中留取2018年11月至2019年3月的新生兒黃疸患兒49 例作為G6PD基因突變檢測對象，男性33 例，女性16 例，其中37 例患兒為病理性黃疸，占75.51%，12 例患兒為生理性黃疸，占24.49%。日齡2 h 至20 d。本研究通過院倫理委員會批準，并獲得患兒法定監護人的知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集對49 名新生兒黃疸患兒進行靜脈采血1.0～2.0 mL，EDTA 抗凝，-20℃保存。

1.2.2 基因提取

采用吸附柱法，首先利用裂解液促使細胞破碎，使細胞內核酸釋放出來；然后將釋放的核酸特異性地吸附在特定的硅膠膜上；然后將吸附在硅膠膜上的核酸用洗脫液洗脫下來，得到純化的核酸。用超微量分光光度計NP80Touch 測定提取的DNA 樣本的濃度和純度，DNA 樣本的OD260nm/OD280nm 應在1.6～2.0 范圍之間，且OD260nm/OD230nm≥2.0。

1.2.3G6PD基因突變檢測

使用上海宏石醫療科技有限公司生產的熒光定量PCR 儀（型號：SLAN-96S），應用廈門致善生物科技股份有限公司生產的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變檢測試劑盒（熒光PCR 熔解曲線法，批號：17121501、18120601）進行G6PD基因突變，具體方法如下：PCR 擴增反應體系設為25 μL，PCR反應程序為：50℃2 min-95℃10 min→（95℃15 s →65℃～56℃（每個循環下降1℃）15 s →76℃20 s）×10 個循環→（95℃15 s →55℃15 s →76℃20 s）×50 個循環。使用實時熒光PCR 儀，共有FAM、HEX、ROX 和Cy5 四個通道，設置在55℃退火階段時采集熒光信號。熔解曲線分析程序設置如下：95℃1 min →35℃3 min →40℃～85℃以0.4℃/5 s的升溫速率進行熔解曲線分析，且在此階段采集FAM、HEX、ROX 和Cy5 通道熒光信號。將待測樣本八個檢測通道（A、B 體系中）的熔解峰與野生型對照對應通道的熔解峰之間熔點（Tm 值）的差異進行比較，從而判斷核酸樣本是否發生G6PD基因突變。與野生型對照對應熔解峰比較差異（ΔTm 值）在±1℃以內的樣本熔解峰為野生型峰，差異超過±2℃即為突變型峰。

1.2.4 膽紅素測定

使用美國貝克曼庫爾特有限公司生產的全自動生化分析儀（型號：AU5421），采用北京九強生物技術股份有限公司生產的總膽紅素測定試劑盒（釩酸鹽氧化法，批號：17-0603、18-0605）和直接膽紅素測定試劑盒（釩酸鹽氧化法，批號：17-0615、18-0612），血清膽紅素在PH3.0 的條件下，會與釩酸反應，生成膽綠素，通過檢測膽紅素氧化前后的吸光度變化，可以計算出樣品血清中膽紅素濃度水平。

1.2.5 葡萄糖6-磷酸脫氫酶活性檢測

采用比值法，在吩嗪二甲酯硫酸鹽遞氫的促進下，NADPH 的H 傳遞給氧化型NBT（硝基四氮唑藍）（黃色），使之轉變為還原型NBT（藍色），藍色的深淺與NADPH 生成量一致（S1）；同法測定6PG 生成的NADPH 的量（S2），通過S1/S2 判斷NADPH 生成的相對含量，從而判斷G6PD是否缺乏。

1.2.6 統計學方法

采用SPSS 軟件進行分析；計數資料以（%）表示；計量資料以（）表示，各組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 G6PD 基因突變檢測結果

49 例新生兒黃疸患兒之中，共檢出3 例G6PD基因突變，發生率為6.12%，其中c.1376G＞T純合突變2 例（66.67%），c.95A＞G 純合突變1 例（33.33%）。基因突變患兒均為男嬰。G6PD基因突變率為6.12%。其余未檢出突變。3 例突變病例均為病理性黃疸，G6PD酶活性均有大幅降低，數值為0.62±0.24（U/gHb），病理性黃疸突變率為8.10%。

2.2 生理性黃疸和病理性黃疸之間各實驗指標差異

生理性黃疸組與病理性黃疸組之間總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、血紅蛋白、紅細胞壓積、網織紅細胞絕對值比較，差異有統計學意義（t=-14.15、-3.55、-14.12、-3.93、-3.62、2.79，P＜0.05）；兩組超敏CRP、紅細胞數比較，差異無統計學意義（t=-0.47、-2.73，P＞0.05）。見表1。

表1 生理性與病理性黃疸之間實驗室相關指標比較（±s）Table 1 Comparison of related laboratory indicators between physiological and pathological jaundice（±s）

表1 生理性與病理性黃疸之間實驗室相關指標比較（±s）Table 1 Comparison of related laboratory indicators between physiological and pathological jaundice（±s）

分組生理性黃疸組病理性黃疸組t 值P 值n 43 91總膽紅素（μmol/L）153.97±49.80 283.69±49.00-14.15＜0.05直接膽紅素（μmol/L）16.67±8.71 23.85±14.60-3.55＜0.05間接膽紅素（μmol/L）137.29±46.63 259.84±47.44-14.12＜0.05超敏CRP（mg/L）2.19±3.11 2.68±4.48-0.47＞0.05血紅蛋白（g/L）142.28±20.09 156.61±18.91-3.93＜0.05紅細胞（×1012）4.15±0.63 4.44±0.58-2.73＞0.05紅細胞壓積（L/L）0.41±0.06 0.45±0.05-3.62＜0.05網織紅細胞絕對值（×1012）0.18±0.09 0.12±0.07 2.79＜0.05

3 討論

本研究結果與文獻結果［5］一致，表明了直接膽紅素、間接膽紅素、血紅蛋白、紅細胞壓積等實驗室相關指標作為輔助判斷生理性黃疸和病理性黃疸的有效指標有一定價值。當數值較高時，就可提前預測病理性黃疸，及時進行預防。Newman［6］等也曾提出網織紅細胞可用于診斷新生兒黃疸。

遺傳因素是引起新生兒黃疸的重要原因之一，有研究表明G6PD基因突變、GST基因多態性、UGT1A1基因多態性［7］等遺傳因素與新生兒黃疸有明確的相關性。我國G6PD基因缺陷及其引起的G6PD缺乏癥［8］導致新生兒黃疸臨床多見。2004年美國兒科學會在《新生兒高膽紅素血癥診療方案》中將G6PD缺乏作為≥35 周新生兒黃疸的高危因素［9］。

至今，世界范圍內已發現的140 多種G6PD基因突變型［10］，呈高度異質性，除第3 和第13 外顯子外，整個基因皆可發生突變，且在所發現的基因突變型中，85.4%表現為單個堿基置換的錯義突變，另有8.0%為復合突變［11］。但半數突變并不影響酶的活性，不引發溶血。G6PD基因突變在不同的地域以及不同的民族之間有著較高的異質性，我國G6PD基因突變的分布情況呈現“南高北低”勢態［12］，其中尤以云南、四川、貴州、廣東、廣西等地為高發區。中國人群中以G1388A、G1376T、C1024T、C1044T、G871A 和A95G6 種點突變多見；非洲人中常見G202A、A376G 和G680T 等點突變；地中海人群中，最常見的突變是C563T。本次研究定性檢測人外周血基因組DNA 中中國人群常見的12 種G6PD基因突變：c.95A＞G、c.383T＞C、

c.392G＞T、c.487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A。本研究還對49 例新生兒黃疸進行了G6PD基因突變檢測，共檢出3 例G6PD基因突變，其中c.1376G＞T 突變是主要的G6PD突變型之一，它也是中國人群中最常見的點突變類型之一，此與湖南長沙地區［13］、廣西百色地區［14］、柳州地區［15］、潮州市［16］、?？诘貐^［17］等地的主要G6PD基因突變型一致。

G6PD基因位于X 染色體長臂2 區8 帶（Xq28），長約18 kb，其中含有12 個內含子和13 個外顯子，可編碼515 個氨基酸，正常野生型為G-6-PDB。G-6-PD 缺乏癥系由其基因變異所致，是一種伴X染色體不完全顯性遺傳?。?8］，女性純合突變及男性突變均會引起嚴重臨床表現，呈重度缺陷。而女性雜合突變臨床表現可正常，但也可能將缺陷基因遺傳給下一代，表現正常的女性雜合突變要用基因檢測進行診斷［19］。目前認為G6PD基因突變主要為單個堿基置換導致的錯義突變改變編碼蛋白質，從而使蛋白質的生物功能出現差異。這種改變的完成通常包括兩個機制：改變G6PD功能結構區的功能和影響G6PD二聚體的形成。G6PD功能結構區包括NADP+（氧化型輔酶Ⅱ）和G6P（葡萄糖-6-磷酸）結合區。突變位于氨基酸則引起的臨床癥狀較輕，而突變位于羧基端則引起的臨床表現較重，尤其是位于NADP+結合區或G6P 結合區時臨床表現最為嚴重。當c.1376G＞T 突變或c.1388G＞A 突變時，置換位置出現在NADP+結合區的附近，可能影響NADP+結合區和G6P 結合區的功能，故常出現較為嚴重的新生兒黃疸及溶血。

G-6-PD 參與的磷酸己糖旁路代謝途徑，是唯一能產生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate，NADPH）的來源。NADPH 是一種重要的還原物質，存在于紅細胞中，可將氧化型谷胱甘肽經還原反應轉變為還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH），而GSH 可以使巰基的蛋白質、酶受到保護，免受氧化劑（尤其是過氧化物）的損害，保護紅細胞膜的完整性。由于G-6-PD 基因變異所致的酶活性下降，會導致GSH 不足，當機體接觸氧化物質（如某些藥物）后，血紅蛋白氧化變性，細胞膜被損傷，發生溶血，導致患者出現黃疸。

目前針對G6PD基因突變患者的治療無根治療法，以疾病發作時對癥治療為主，嚴重者治療效果不佳，在基因水平上修復這些突變位點將改善這一現狀。目前，已經有學者成功構建了HEK293T穩定細胞株，這是一種能夠敲除G6PD基因c.392G＞T 突變位點的細胞株，該研究成果為后期研究其基因修復奠定了基礎［20］。有研究證明［21］，花生四烯酸能夠抑制磷脂酰肌醇3 激酶（Phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）通路，同時還能抑制G6PD突變基因的表達，其機制是通過p38 絲裂原激活的蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK），磷酸化胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）的307 位絲氨酸。還有學者構建動物實驗研究發現可以通過多不飽和脂肪酸激活剪接沉默子而減少G6PD 基因前體mRNA的表達。

綜上所述，G6PD 基因突變與新生兒黃疸有著密切的相關性。隨著對G6PD 基因突變與新生兒黃疸的關系的深入研究，可以對新生兒黃疸患者進行基因檢測，判斷G6PD 基因突變型與新生兒膽紅素濃度關系，從而進行黃疸動物模型建立考察藥物或基因編輯等手段對黃疸的消退作用，預測新生兒黃疸的可能性并及時對癥處理。