骨髓CKS1B、p53基因表達對多發性骨髓瘤患者化療效果及預后的評估價值

廖彩翔 黎國偉 秦曉鏵

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種漿細胞惡性增殖性疾病，多發于中老年人。近年來，隨著靶向藥及造血干細胞移植的應用，MM 患者預后明顯改善，但因MM 為異質性極強的腫瘤，患者生存期從數月到數十年不等［1］。決定MM 患者預后異質性的主要因素為細胞遺傳學異常，MM 患者最常見的結構異常為1 號染色體異常，其中45%MM 患者1q 擴增均涉及1q21［2］。1q21 包含一個CKSIB基因，為高度保守的細胞周期蛋白激酶亞基1 蛋白家族成員之一，該家族與細胞周期蛋白依賴激酶（CDKs）互相作用，影響細胞周期進程，因此可能在MM 發病機制中有一定應用價值［3］。p53基因最易發生異常，野生型p53 可誘導細胞凋亡，負性調節細胞周期［4］。但目前鮮有報道關于p53基因在MM 患者中的表達情況，而國內尚未見CKSIB在MM 患者中的作用。本研究通過分析MM 患者化療后骨髓CKSIB、p53基因表達，旨在探討其在MM 患者中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年6月至2022年3月收治于惠州市中心人民醫院的86 例MM 患者作為研究對象。所有患者化療4 個療程（硼替佐米+地塞米松+來那度胺，28d 為1 個療程）后根據2014 國際骨髓瘤工作組標準將86 例MM 患者分為有效組（n=53）和無效組（n=33）。其中男59 例，女27 例；平均年齡（68.15±4.57）歲；納入標準：①符合國際骨髓瘤工作組診斷標準［5］；②有完整的臨床資料及隨訪資料。排除標準：①患有其他血液系統疾病；②患有認知障礙患者。所有患者或家屬均已簽署知情同意書。本研究通過醫院倫理委員會審核并批準。

1.2 療效評估標準［5］

完全緩解（CR）：血清和尿液免疫固定電泳均為陰性，軟組織漿細胞瘤消失，骨髓中漿細胞＜5%；部分緩解（PR）：M 蛋白減少≥50%，24 h 尿M蛋白減少≥90%或降至＜200 mg/24 h；骨髓內漿細胞數量減少≥50%；疾病穩定（SD）：血清M 蛋白減少≥50%；疾病進展（PD）：M 蛋白最低值≥5 g/dL，尿M 蛋白≥200 mg/24 h，骨髓漿細胞比例增加25%。

1.3 FISH 法檢測骨髓CKS1B、p53 基因表達

漿細胞純化：采用CD138 抗體MACS 分選漿細胞，詳細步驟參考文獻［6］，將分選的漿細胞用常規方法低滲，將染色體置-20℃條件下備用。

CKS1B/CDKN2C 所用試劑盒：安必平（LBP）1q21/1p32 基因探針，廠家：安必平；P53 所用試劑盒：慢性淋巴細胞白血病染色體及基因異常探針檢測試劑盒TP53/CEP17 雙色探針，廠家：康錄生物。取出標本，用甲醇/冰醋酸（3∶1）固定液，然后氣千法滴片，在37℃2×SSC 中老化30 min，分別在70%、85%、100%乙醇各脫水2 min。把標本用70%甲酰胺/2×SSC 變形3 min。每個標本滴加探針1 μL，用雜交稀釋液4 μL 混合均勻，水浴（72℃）變性5 min。加探針5 μL 于帶雜交區，蓋玻片后雜交過夜。將玻片放入72℃0.4×SSC/0.3%吐溫中2 min，2×SSC/0.1%吐溫中1 min 后將玻片晾干。待15 min 后用熒光顯微鏡進行觀察，具體探針閾值：1q21 擴增為5.5%、P53 缺失為6.0%。CKS1B（1q21）擴增、CDKN2C（1p32）缺失、TP53 的陽性截斷值為20。每例MM標本分析≥100 個骨髓瘤細胞，計算陽性信號出現的百分率，超過截斷值則判定為陽性［7］。

1.4 臨床資料收集

收集所有患者的相關臨床資料，包括年齡、性別、（Durie-Salmon，DS）分期、國際分期體系（International Staging System，ISS）分期、修正的國際分期體系（Revised-International Staging System，R-ISS）分期、血β2-微球蛋白、C 反應蛋白、血鈣、乳酸脫氫酶、血紅蛋白等。MM 患者疾病分期依據《血液病診斷及療效標準》［8］中DS 分期、ISS 分期及R-ISS 分期標準進行評估。其中R-ISS 分期Ⅰ期：乳酸脫氫酶（LDH）水平正常和細胞遺傳學標危患者；Ⅱ期：不符合R-ISS-Ⅰ期和Ⅲ期患者；Ⅲ期：符合R-ISS-Ⅲ期且為細胞遺傳學高危或LDH 偏高患者。

1.5 隨訪

所有患者均通過電話或門診復診形式隨訪，患者疾病進展情況及生存狀態，本研究中末次隨訪截止日期為2022年5月31日，無失訪。隨訪時間至少3年，69 例疾病穩定，17 例疾病進展。

1.6 統計學方法

應用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析。計數資料以n（%）表示，用χ2檢驗；并以Cox風險比例模型分析骨髓CKS1B、p53表達與MM 患者預后的關系。以Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并以Log-Rank法進行組間生存差異檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組骨髓CKS1B、p53 陽性表達率比較

有效組MM 患者骨髓CKS1B、p53陽性表達率顯著低于無效組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組骨髓CKS1B、p53 陽性表達率比較［n（%）］Table 1 Comparison of positive expression rates of CKS1B and p53 in bone marrow between two groups［n（%）］

2.2 骨髓CKS1B、p53在MM患者療效監測中的價值

繪制CKS1B、p53 對MM 患者療效監測的ROC曲線分析顯示，CKS1B、p53 的最佳截斷值分別為0.78、0.51，AUC 分別為0.851、0.896，敏感度為75.75%、90.90%，特異度為77.35%、83.01%。見表2、圖1。

表2 骨髓CKS1B、p53 在MM 患者療效監測中的價值Table 2 The value of bone marrow CKS1B and p53 in curative effect monitoring of MM patients

2.3 骨髓CKS1B、p53 陽性表達與MM 患者臨床特點的關系

MM 患者的骨髓CKS1B、p53 陽性表達與R-ISS 分期、C 反應蛋白、血紅蛋白有關，差異有統計學意義（P＜0.05），而與年齡、性別、DS 分期、ISS分期、血β2-微球蛋白、血鈣、乳酸脫氫酶無明顯相關性（P＞0.05）。見表3。

表3 骨髓CKS1B、p53 陽性表達與患者臨床特點的關系Table 3 The relationship between positive expression of CKS1B and p53 in bone marrow and clinical characteristics of patients

2.4 影響MM 患者預后的單因素分析

本研究MM 患者的3年生存率為80.23%（69/86）。單因素分析結果顯示，白細胞、血紅蛋白、血小板、乳酸脫氫酶、血β2-微球蛋白、CKS1B 及p53 是影響MM 患者預后的危險因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響MM 患者預后的單因素分析［n（%）］Table 4 Univariate analysis affecting the prognosis of MM patients［n（%）］

2.5 影響MM 患者預后的Cox 回歸分析

以MM 患者預后為因變量進行Cox多因素回歸分析，結果顯示，白細胞、血紅蛋白、CKS1B 及p53 為MM 患者預后不良的獨立影響因素（P＜0.05），見表5。其中，CKS1B 陽性表達組（71.42%）3年生存率低于陰性表達組（90.90%），p53 陽性表達組（50.00%）3年生存率低于陰性表達組（82.00%），差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表5、圖2。

表5 影響MM 患者預后的Cox 回歸分析Table 5 Cox regression analysis affecting the prognosis of MM patients

圖2 骨髓CKS1B、p53 表達與MM 患者3年生存率的相關性Figure 2 Correlation between the expression of CKS1B and p53 in bone marrow and the 3-year survival rate of MM patients

3 討論

決定MM 患者預后異質性的主要因素為細胞遺傳學異常。近年來，有研究顯示CKS1B 基因位于染色體1q21，為SCFSkp2 泛素化復合體的主要成分，可降解大部分細胞周期調控因子，在多種腫瘤的發生及發展占重要作用［9］。CKS1B 在Skp2 與磷酸化的p27kip1 的結合中起促進作用，使p27kip1 泛素化和隨后經蛋白酶體降解中有重要意義。p27kip1 與Cdk2/cyclin A 復合體結合并抑制細胞周期G1-s 期轉換，所以其降低異常可引發細胞惡性增殖、細胞周期紊亂。

已有相關報道CKS1B 表達過高可導致腫瘤形成，此類患者預后較差［10］。p53 可誘導細胞周期紊亂或細胞凋亡，從而維持基因組的穩定。而腫瘤的特征之一即為基因組不穩定，因此p53 功能異常在腫瘤發生、發展中起重要作用。目前臨床研究較多報道CKS1B、p53 在腫瘤發生發展中的應用，但關于CKS1B、p53 功能異常在MM 發生、發展的作用的研究較少。本研究結果表明CKS1B、p53 與MM 發病有關。兩者陽性表達差異可反映化療療效，可作為MM 患者化療后療效評估的輔助指標。繪制CKS1B、p53 對MM 患者療效監測的ROC 曲線分析顯示，CKS1B、p53 的最佳截斷值分別為0.78、0.51，AUC 分別為0.851、0.896，敏感度為75.75%、90.90%，特異度為77.35%、83.01%。提示骨髓CKS1B、p5 可能對MM 患者有一定的診斷價值。有研究發現［11］，miR-1258 可能通過靶向CKS1B 調控細胞增殖和遷移，提示CKS1B 是癌腫瘤治療的潛在靶點。CKS1 高表達提示腫瘤預后較差和生活質量低下，p53 的高表達與眾多疾病的預后相關，提示兩者是疾病預后的影響因素。本研究發現MM 患者的骨髓CKS1B、p53 陽性表達與R-ISS 分期、C 反應蛋白、血紅蛋白有關，差異有統計學意義，而與年齡、性別、DS 分期、ISS 分期、血β2-微球蛋白、血鈣、乳酸脫氫酶無明顯相關性。本研究MM 患者的3年生存率為80.23%（69/86）。與楊玉［12］、Li 等［13］的研究類似。白細胞、血紅蛋白、CKS1B、p53 高表達可能是導致MM 患者生存期縮短的原因。Hao 等［14］的研究報道染色體1q21/CKS1B 的增加或擴增是骨髓瘤的高危因素，p53 基因缺失也被認為是MM 的高危特征。本研究進一步進行Cox多因素回歸分析，結果顯示，白細胞、血紅蛋白、CKS1B 及p53 為MM 患者預后不良的獨立影響因素，提示CKS1B 及p53 的異常表達對MM 預后帶來不良影響，有可能成為病情監測與預后評估的重要指標之一。

綜上，骨髓CKSIB、p53 對MM 患者療效監測有一定價值，MM 中骨髓CKSIB、p53 陽性表達與白細胞、血紅蛋白及預后密切相關。有望成為MM 療效及預后評估的特異性指標，但本研究不足之處在于樣本量較少，日后需加大樣本量延長隨訪時間驗證相關指標在MM 患者中所發揮的作用。