牙齦組織中MMP-13和TIMP-1的表達與游離齦移植術后應用CGF生長因子創面愈合的關系

于蘭 于文鳳 呂敏敏

游離齦移植術是指將用自體健康的牙齦組織移植到角化齦缺失或不足區域，加寬附著齦，加深前庭溝，目前廣泛用于牙周手術中［1］。但游離齦移植后，供區會出現一個開放的傷口，該傷口一般需要2～4周才能完全恢復，繼發性創傷會影響患者的術后舒適度，嚴重時供區發生感染，造成傷口愈合時間延長［2］。血小板濃縮液能釋放多種生長因子，釋放的生長因子可用于促進傷口愈合和減輕術后疼痛和不適。濃縮血小板生長因子（concentrated growth factors，CGF）是第三代血小板衍生物，相關研究表明，CGF 釋放的多種生長因子可用于促進骨和軟組織的形成，對傷口愈合具有促進作用［3］。基質金屬蛋白酶（matrix mettallo-proteinases，MMPs）是一種主要由結締組織細胞分泌的蛋白酶，能破壞細胞外基質，并參與多種生物作用，如重塑組織、創傷愈合等，其中，基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）和組織金屬蛋白酶抑制劑1（Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）是MMPs 家屬成員之一。以往研究以證實MMPs 在傷口愈合的過程中發揮著積極作用［4］，但MMP-13 和TIMP-1 游離齦移植術后應用CGF 生長因子創面愈合過程中的表達尚不清楚。因此，本研究旨在探討牙齦組織中MMP-13 和TIMP-1 的表達以及游離齦移植術后應用CGF 生長因子創面愈合的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年6月至2021年12月滄州人民醫院口腔科行游離齦移植術的患者82 例作為研究對象。納入標準：①行游離齦移植術者；②年齡＞18歲；③配合度良好；④3 個月內未服用抗生素；⑤所有患者均簽署知情同意書。排除標準：①合并有惡性腫瘤、嚴重基礎疾病、嚴重的心、肝、腎功能不全的者；②有血液或免疫系統基本者；③3 個月內有服用干擾軟組織再生的相關藥物；④存在牙周手術禁忌癥。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 治療方法

兩組患者均行游離齦移植術后，對照組獲得游離齦瓣后，在供體處縫合碘仿紗條，觀察組應用CGF 薄膜覆蓋硬腭供區創面，再用碘仿紗條縫合。

1.2.2 標本提取

于治療后3、7、14、30 d 后局部麻醉后沿牙齦近中、遠中垂直切入牙周袋或齦溝底部，再沿袋底或溝底橫向切開以獲取牙齦組織標本。放置在40 g/L 多聚甲醛中進行2～12 h 的固定。

1.2.3 免疫組化方法

固定標本脫水，透明，石蠟包埋，3 μm 厚切片，60℃烤箱烘烤2 h，經梯度乙醇脫水，pH 為9.0 的Tris-EDTA（pH 為9.0）微波復液修補15 min。在3%的H2O2室溫孵育10 min。滴加按1∶250 稀釋得一抗，在4℃下培養1 晚。非生物素二抗IgG 在37℃下培養15 min。每個步驟均用pH 為7.4 的沖洗3 次，每次沖洗時間為5 min。DAB 染色、蘇木素復染、鹽酸乙醇分化、脫水、透明、中性膠封片。PBS 替代一抗作為陰性對照。在400 倍光鏡下，隨機選取10 個視場進行拍攝，利用Image Pplus 圖像分析測試軟件對圖像進行分析，并對其進行光度平均值的計算。

1.2.4 免疫組化陽性判斷及數據統計

牙齦組織中MMP-13、TIMP-1 均以胞質內呈現棕黃色顆粒為陽性。采用半定量的積分法［5］，對10 個含有陽性細胞高倍鏡視野（×200）進行隨機觀察，兩名病理科醫生進行雙盲法讀片，并對所觀察到的陽性細胞的數量取其平均值進行計數。陽性：MMP-13、TIMP-1 的陽性細胞率為1%～10%，賦予1 分；11%～50%，賦予2 分；51%～75%，賦予3 分，強陽性：陽性細胞率為＞75%；陰性：MMP-13、TIMP-1 的陽性細胞率為0 或高倍鏡視野下細胞質內未見棕黃色顆粒。低表達：陽性細胞率≤3 分，高表達：＞3 分。

1.3 觀察指標

1.3.1 創面愈合率［6］

治療后3、7、14、30 d 后用單反相機記錄創面愈合情況。以一定的標準長度（參考牙周探針）和單反相機鏡片垂直于組織創面的條件下進行創面拍攝，應用ImagePlus6.0 軟件進行面積測量。創面愈合率=（初始創面面積-未愈合創面面積）/初始創面面積×100%。

1.3.2 實驗室指標

治療后3、7、14、30 d 后比較兩組牙齦組織中MMP-13 和TIMP-1 的表達情況。比較觀察組MMP-13 和TIMP-1 水平表達情況與創面愈合的關系。相關性分析觀察組治療30 d 創面面積愈合率與牙齦組織中TIMP-1 的關系。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料以（）表述，行t檢驗，計數資料以n（%）表述，采用χ2檢驗，用Pearson 相關性分析MMP-13和TIMP-1 與創面愈合的關系。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組創面愈合率比較

隨治療時間的延長，觀察組的創面面積愈合率逐漸升高，觀察組高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組創面愈合率比較（±s）Table 1 Comparison of wound healing rates between the two groups（±s）

表1 兩組創面愈合率比較（±s）Table 1 Comparison of wound healing rates between the two groups（±s）

組別觀察組對照組t 值P 值n 41 41 3 d 2.60±0.48 2.20±0.60 3.316 0.002 7 d 34.02±4.87 30.24±4.06 3.817 0.000 14 d 48.90±7.15 44.79±10.18 2.115 0.037 30 d 62.09±10.65 55.72±8.93 2.934 0.004

2.2 兩組MMP-13 表達情況比較

隨治療時間的延長，觀察組牙齦組織中MMP-13 的表達水平逐漸下降，觀察組低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 兩組MMP-13 表達情況比較（±s）Table 2 Comparison of MMP-13 expression between the two groups（±s）

表2 兩組MMP-13 表達情況比較（±s）Table 2 Comparison of MMP-13 expression between the two groups（±s）

組別觀察組對照組t 值P 值n 41 41 3 d 0.72±0.03 0.74±0.04 2.561 0.012 7 d 0.67±0.03 0.69±0.05 2.196 0.031 14 d 0.54±0.05 0.59±0.04 5.000 0.000 30 d 0.50±0.03 0.53±0.02 5.327 0.000

2.3 兩組TIMP-1 表達情況比較

隨治療時間的延長，觀察組牙齦組織中TIMP-1的表達水平逐漸上升，觀察組高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3、圖1。

圖1 2 組牙齦組織中TIMP-1、MMP-13 的表達（SP，×400）Figure 1 Expression of TIMP-1 and MMP-13 in gingival tissue of two groups（SP，×400）

表3 兩組TIMP-1 表達情況比較（±s）Table 3 Comparison of TIMP-1 expression between the two groups（±s）

表3 兩組TIMP-1 表達情況比較（±s）Table 3 Comparison of TIMP-1 expression between the two groups（±s）

組別觀察組對照組t 值P 值n 41 41 3 d 0.49±0.03 0.47±0.04 2.561 0.012 7 d 0.56±0.12 0.50±0.13 2.171 0.032 14 d 0.69±0.18 0.60±0.20 2.141 0.035 30 d 0.77±0.17 0.59±0.13 5.385 0.000

2.4 觀察組MMP-13 和TIMP-1 水平表達情況與創面愈合的關系

MMP-13 的高表達組創面愈合率顯著低于低表達組，差異有統計學意義（P＜0.05）。TIMP-1 的高表達組創面愈合率顯著高于低表達組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 觀察組MMP-13 和TIMP-1 水平表達情況與創面愈合的關系［n（%），（±s）］Table 4 The relationship between the expression of MMP-13 and TIMP-1 in observation group and wound healing［n（%），（±s）］

表4 觀察組MMP-13 和TIMP-1 水平表達情況與創面愈合的關系［n（%），（±s）］Table 4 The relationship between the expression of MMP-13 and TIMP-1 in observation group and wound healing［n（%），（±s）］

項目MMP-13高表達（n=26）低表達（n=15）t 值P 值TIMP-1高表達（n=14）低表達（n=27）t 值P 值創面愈合率60.08±8.34 65.79±7.16 2.218 0.032 67.80±8.78 61.15±7.75 2.490 0.017

2.5 觀察組治療30 d 創面面積愈合率與牙齦組織中MMP-13、TIMP-1 的相關性分析

Pearson 相關性分析結果顯示，觀察組治療30 d創面面積愈合率與牙齦組織中MMP-13 表達水平呈負相關（r=-0.031，P=0.035），與牙齦組織中TIMP-1表達水平呈正相關（r=0.403，P=0.009）。見圖2。

圖2 觀察組治療30 d 創面面積愈合率與牙齦組織中MMP-13、TIMP-1 的相關性分析Figure 2 Correlation analysis between wound healing rate and MMP-13、TIMP-1 in gingival tissue in the observation group after 30 days of treatment

3 討論

修復各種由外傷或醫源性引起的軟組織缺損，是臨床上普遍存在的問題。傷口的愈合是一個復雜的過程，需要各種膠原、可溶性介質、細胞因子、炎癥細胞等多種因素的綜合作用。目前，FGG術后腭部供區粘膜創面修復的方法較多，如血小板濃縮物等血液制品中豐富的生長因子，可以促進創面愈合。相關研究表明，濃縮生長因子能促進人牙齦成纖維細胞的增殖和分化，并促進種植體軟組織的再生，對口腔種植體骨組織的起修復作用［7］。基質金屬蛋白酶與基質金屬蛋白酶抑制劑的動態平衡在修復組織細胞、炎性細胞遷移、促進創面上皮化等方面也發揮著關鍵作用，其中，MMP-13、TIMP-1均屬于MMPs 家族［8］7。但MMP-13、TIMP-1 與游離齦移植術后應用CGF 治療創面愈合中具體機制仍不清楚，需要深入探究其在牙齦組織中表達情況，分析其與創面愈合的關系。

血小板濃縮物由自提全血離心所得，CGF 是第三代血小板衍生物，與富血小板血漿、富血小板纖維蛋白相比，CGF 中含有更豐富的生長因子，具有較強的細胞增殖和修復作用。本研究結果顯示，隨治療時間的延長，觀察組的創面面積愈合率逐漸升高，觀察組高于對照組。由于CGF 中的生長因子較為豐富，治療時間越長，觀察組表現出較對照組更好的創面愈合效果。CGF 中富含纖維蛋白支架、血管內皮生長因子、胰島素樣生長因子以及表皮生長因子等，這些生長因子對上皮細胞的增殖有明顯的促進作用，并能在創面中形成新的血管網絡，從而保證硬腭供區的營養供給［9］。此外，CGF 膜中豐富的生長因子，能夠滿足機體早期修復所需，且與細胞間存在良好的協同效應，彌補了單一生長因子對組織修復的影響，加快缺損區的修復。本研究結果顯示，隨治療時間的延長，MMP-13 的表達水平逐漸下降，觀察組低于對照組。慢性難愈合創面是由于過多的炎性因子作用所致，早期可見到少量MMP-13 及TIMP-1 的表達，到晚期時，由于大量的炎癥因子存在，導致機體內MMP-13 和TIMP-1 被釋放，破壞創面的正常組織，導致機體形成久不愈合的狀況［10-11］。MMP-13是多種炎癥因子最后作用的靶分子，TIMP-1 參與炎癥細胞浸潤和轉移的過程，本研究創面愈合的其作用機理考慮是通過降低MMP-13、TIMP-1 的表達水平相關［12-13］。MMP-13、TIMP-1 在上皮細胞再生及傷口愈合中具有重要作用。本研究結果顯示，MMP-13 高表達組創面愈合率均低于低表達組，TIMP-1 高表達組創面愈合率均高于低表達組。MMP-13 參與多種正常的生理、病理過程，如組織愈合、形態形成和修復，當創面愈合程度越高，MMP-13 表達水平越低［14］。TIMP-1 的高水平表達可能通過對MMPs 的清除、細胞的遷移以及細胞外基質的降解等作用，從而起到促進傷口的愈合效果［15］。本研究Pearson 相關性分析顯示，觀察組術后30d 創面面積愈合率與牙齦組織中MMP-13表達水平呈負相關，與TIMP-1 表達水平呈正相關。因此，術后通過監測患者牙齦組織中MMP-13、TIMP-1 表達情況，而給予針對性的治療，及時糾正游離齦移植術后供區創面的微環境，可促進創面的愈合。

綜上所述，行游離齦移植術后應用CGF 生長因子治療患者牙齦組織中MMP-13 的表達水平逐漸下降，TIMP-1 的表達水平逐漸逐漸升高，兩者與創面愈合率密切關聯，CGF 生長因子可能通過調控MMP-13 和TIMP-1 之間的關系以達到促進創面愈合的目的。