陰道壁組織中TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達在盆底功能障礙患者中的臨床意義

汪新宇 程永玲 劉曉寧 管曉卿

盆底功能障礙（pelvic floor dysfunction，PFD）是由于各種病因導致盆底支持組織變得薄弱，使盆腔臟器發生移位，從而導致盆腔器官的位置和功能出現異常，主要包括子宮脫垂及陰道前后壁松弛等盆腔器官脫垂（Pelvic organ prolapse，POP）及壓力性尿失禁（Stress urinary incontinence，SUI），該疾病的發生與支撐盆腔器官的陰道和盆底組織機械功能減退有關。目前認為，細胞外基質的膠原蛋白的變化可導致盆底支持組織損傷，破壞盆底完整結構，從而導致PFD 的發生［1］。相關研究指出，轉化生長因子-β1（Transforming Growth factor-β1，TGF-β1）、基質金屬蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9，MMP-9）表達與細胞外基質結構的完整性相關［2］。亦有報道發現，TGF-β1 與膠原蛋白的生成和降解有關［3］。TGF-β1 是一組具有多種功能的蛋白多肽，是細胞外基質的一類生物活性分子，在骨組織和血小板中含量最為豐富，可調節膠原代謝，促進膠原、纖維蛋白的表達，抑制細胞外基質膜的分解，進而影響PFD 的發生發展過程；而MMP-9 可直接影響局部組織中多種類型膠原蛋白的生成、結構和功能，可降解細胞外基質膜的有效成分、調節細胞黏度而抑制PFD 患者的盆地組織正常功能。核因子E-2 相關因子2（nuclear factor E-2 related factor，NrF 2）是一類細胞核轉錄因子家族蛋白，目前對于其與PFD 發生的關系尚無定論。故本研究通過分析PFD 患者陰道壁組織中TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達，旨在探究其與PFD的發生發展的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年3月至2021年7月于涿州市醫院就診的92 例PFD 患者為研究對象，根據疾病類型將其分為POP 組（35 例）、SUI 組（31 例）及POP 合并SUI 組（26 例），并以47 例健康婦科檢查者為對照組。POP 組：平均年齡（39.87±4.05）歲，平均孕次（2.25±0.34），平均產次（1.71±0.30）次，絕經7 例。SUI 組：平均年齡（38.64±4.21）歲，平均孕次（2.15±0.37）次，平均產次（1.72±0.25）次，絕經9 例。POP 合并SUI 組：平均年齡（39.09±4.17）歲，平均孕次（2.19±0.31）次，平均產次（1.75±0.28）次，絕經5例。對照組：平均年齡（40.05±4.73）歲，平均孕次（2.21±0.35）次，平均產次（1.79±0.25）次，絕經10 例。納入標準：①符合有關PFD 的診斷標準［4］；②存在尿失禁、慢性盆腔疼痛者；③臨床資料完整者。排除標準：①合并嚴重心肝腎功能異常者；②既往有盆腔手術史者；③合并嚴重婦科疾病患者；④合并惡性腫瘤疾病患者；⑤妊娠期婦女；⑥盆腔神經損傷者。本研究經院倫理委員會批準同意，研究對象均知情同意。

1.2 方法

①標本采集：于患者盆底手術中在膀胱頸與尿道連接處旁開1.5 cm 處，留取陰道前壁組織約1 cm3，用生理鹽水充分洗凈后，放入高壓滅菌的Eppendorf 管后立即置入液氮中保存。②總RNA提取及逆轉錄：應用大連寶生物工程有限公司RNAiso Reagent 試劑盒進行總RNA 提取，并逆轉錄合成cDNA。③PCR 反應：TGF-β 1、MMP-9、Nrf 2基因的PCR 引物采用Primer5.0 引物軟件設計［TGF-β1引物序列：上游：5′-ACCCACAAGGAAA TCTATGACA-3′，下游：5′-GCTGAGGTATCGTTAGGAAT-3′；MMP-9引物序列：上游：5′-TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3′，下游：5′-CGGGAAGT CTTCCGAGTAGTTT-3′；Nrf 2引物序列：上游：5′-GTCGACATGAAGCACCTGAAGCGG-3′，下游：5′-GGATCCCTTTCTCTTTCCCTTTTG-3′］，并用GenBank Blast 進行同源性比對，引物序列由奧科生物科技有限公司合成。④產物鑒定：取6 μL PCR 產物，進行凝膠電泳，經GelDolXR 凝膠成像及Quantity one 分析系統進行圖像分析，以β-actin為內參物，測定TGF-β1、MMP-9、Nrf 2和β-actin的平均積分光密度，以其與β-actin的比值表示其表達相對水平。

嚴重程度分組：參照Cullen PK Jr 等［5］方法及《女性壓力性尿失禁診斷和治療指南（2017）》［6］將SUI 分為Ⅰ～Ⅳ度。根據《婦產科學》第6 版［4］中關于POP 標準將POP 患者分為Ⅰ～Ⅲ度。

1.3 統計學處理

采用SPSS 25.0 軟件進行數據處理；計數資料以%表示，采用χ2檢驗；計量資料經正態檢驗后用（）表示，用t檢驗比較兩組間差異，用單因素方差分析比較多組間差異；采用ROC 曲線分析TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達量對POP、SUI 的鑒別價值；采用spearman 檢驗分析TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達量與POP、SUI 嚴重程度的相關性。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組及對照組TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達比較

POP 合并SUI 組的TGF-β1表達量低于POP組、SUI 組，MMP-9、Nrf 2表達量高于POP 組、SUI組，差異有統計學意義（P均＜0.05）；POP 組、SUI組、POP 合并SUI 組的TGF-β1表達量低于對照組，MMP-9、Nrf 2表達量高于對照組，差異有統計學意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 四組患者的TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達比較（±s）Table 1 Comparison of TGF-β1，MMP-9 and Nrf 2 among the four groups（±s）

表1 四組患者的TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達比較（±s）Table 1 Comparison of TGF-β1，MMP-9 and Nrf 2 among the four groups（±s）

注：與POP 合并SUI 組比較，aP＜0.05；與對照組比較，bP＜0.05。

Nrf2 0.31±0.05ab 0.34±0.06ab 0.42±0.07b 0.15±0.03 182.27＜0.001組別POP 組SUI 組POP 合并SUI 組對照組F 值P 值n 35 31 26 47 TGF-β1 0.31±0.04ab 0.29±0.05ab 0.22±0.06b 0.40±0.08 51.857＜0.001 MMP-9 0.27±0.05ab 0.31±0.05ab 0.43±0.06b 0.09±0.02 363.929＜0.001

2.2 TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達對POP 及SUI 的鑒別價值

TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達單獨檢測及聯合檢測鑒別POP 及SUI 的AUC 分別為0.629、0.637、0.653、0.665。見表2、圖1。

表2 TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達對POP 及SUI 的鑒別價值Table 2 The differential value of TGF-β1，MMP-9 and Nrf 2 for POP and SUI

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curves

2.3 不同嚴重程度POP 及SUI 患者的TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達比較

TGF-β1表達隨POP、SUI 病情的加重而降低，MMP-9、Nrf 2表達隨POP、SUI 病情的加重而增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同嚴重程度POP 及SUI 患者的TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達比較（±s）Table 3 Comparison of TGF-β1，MMP-9 and Nrf 2 in patients with different severity of POP and SUI（±s）

表3 不同嚴重程度POP 及SUI 患者的TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達比較（±s）Table 3 Comparison of TGF-β1，MMP-9 and Nrf 2 in patients with different severity of POP and SUI（±s）

組別POP nⅠ度Ⅱ度Ⅲ度F 值P 值Ⅰ度Ⅱ度Ⅲ～Ⅳ度F 值P 值23 21 17 SUI 17 26 14 TGF-β1 0.31±0.06 0.28±0.06 0.21±0.05 15.936＜0.001 0.28±0.04 0.26±0.05 0.23±0.04 5.048＜0.05 MMP-9 0.27±0.05 0.34±0.06 0.43±0.08 33.278＜0.001 0.31±0.05 0.35±0.06 0.46±0.06 29.600＜0.001 Nrf 2 0.32±0.05 0.36±0.05 0.40±0.07 10.486＜0.001 0.33±0.06 0.37±0.07 0.45±0.08 12.275＜0.001

2.4 TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達與POP、SUI 嚴重程度的相關性分析

TGF-β1表達與POP、SUI 嚴重程度呈負相關，MMP-9、Nrf 2表達與POP、SUI 嚴重程度呈正相關。見表4。

表4 TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達與POP、SUI 嚴重程度的相關性分析Table 4 Correlation between TGF-β1，MMP-9，Nrf 2 and the severity of POP and SUI

3 討論

PFD 又稱為盆地缺陷或盆底支持組織松弛，好發于中老年婦女，會給患者帶來一系列精神、生理方面的困擾，嚴重影響其生存質量［7］。據統計顯示，老年婦女的PFD 患病率高達50%，是影響中老年女性身心健康的主要疾?。?］。目前認為，盆底結締組織結構及功能與PFD 的發生發展過程密切相關。膠原蛋白是盆底支持組織細胞外基質的主要成分，細胞外基質降解可導致盆底支持組織膠原蛋白含量減少，使得支持組織彈性兼容，而造成盆底結構損傷、松弛，最終導致PFD［9］。相關報道指出，MMP 相關因子與彈性蛋白、膠原蛋白相關，參與了細胞外基質的重構過程［10］。MMP-9 是MMP家族成員之一，具有蛋白水解功能，其可分解細胞外基質，可降解膠原、改變膠原蛋白的形狀，可降解細胞外基質的所有成分，破壞細胞外基質正常結構和功能。分娩、產傷等因素使得女性盆底結締組織受損后，可促進MMP-9 分泌，影響細胞外基質的合成及降解，進而導致盆底結構改變。TGF-β1是一種多功能生長因子，可調節細胞生長分化，抑制炎癥。相關研究指出，TGF-β1 能刺激細胞及細胞外基質中大多數膠原基因的表達，并能促進膠原蛋白產物分泌［11］。NrF 2 可通過參與細胞內的氧化應激反應來控制細胞周期，目前臨床上有關其與PFD 發生過程的報道較少。本研究表明PFD患者存在MMP-9、Nrf 2異常表達現象，且POP 患者合并SUI 可促進MMP-9、Nrf 2分泌，抑制TGF-β1表達，其原因目前尚不可知，故后期需進行進一步探究。POP 及SUI 是兩種不同的PFD 類型，治療方法也存在差異。POP 是指盆腔器官疝出至陰道壁及超出陰道壁，主要采用陰道子宮托及修補手術治療；SUI 是一種常見疾病，表現為尿液不自主流出，目前尚無有效藥物治療方案，主要通過盆底肌肉鍛煉、膀胱訓練等進行治療。本研究發現，TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達鑒別POP 及SUI 的AUC 均小于0.7，表明其對POP、SUI 的鑒別價值較低，故不建議通過檢測TGF-β1等來鑒別不同類型PFD。

盆底結締組織細胞外基質的主要成分為膠原蛋白、彈性蛋白等，有助于維持正常盆地結構［12］。在正常生理條件下，成纖維細胞釋放的纖維蛋白原及其溶解處于平衡狀態，但在病理狀態下，TGF-β1可刺激細胞外基質合成，誘導纖維酶活化因子抑制因子及膠原酶的合成釋放，進而抑制膠原降解［13］。TGF-β1 對膠原的調控機制較為復雜，可通過自分泌調控方式及細胞因子的網絡調控，間接調控膠原膠原相關基因的轉錄、翻譯水平，并能維持相關蛋白質穩定性［14-15］。臨床資料顯示，MMP-9 與細胞外基質的合成及降解代謝有關，而盆底結締組織一旦受到損傷或炎癥刺激，其所產生的細胞炎性因子即能激活MMP-9，而影響結締組織細胞外基質的重建和修復［16-17］。本研究結果提示POP、SUI 患者TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達或與病情嚴重程度相關，經進一步分析發現，TGF-β1表達與POP、SUI 嚴重程度呈負相關，MMP-9、Nrf 2表達與POP、SUI 嚴重程度呈正相關，表明TGF-β1、MMP-9、Nrf 2或參與了PFD 的發生發展過程，其原因TGF-β1 水平降低可促進MMP表達，從而抑制陰道膠原合成，進而可加重病情。

綜上所述，PFD 患者陰道壁組織TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達與病情嚴重程度相關，且不同類型患者TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達水平不同，但其對PFD 患者類型鑒別價值較低。但本研究尚存在不足之處，納入樣本量較少且為回顧性分析，可能會影響研究結果的準確性，故后期需增加樣本量，并進行前瞻性研究，排除其他因素對本研究的影響，以減少研究過程中的誤差，提高研究結果的可靠性。