抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體檢測方法學(xué)研究進(jìn)展

邢娜娜，張娜麗，王文強(qiáng)，孫萌，李忠信

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南鄭州 450016）

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（anti-neutrophilcytoplasmic antibodies,ANCA）于1959年首次在慢性炎癥疾病患者被發(fā)現(xiàn)[1]，但直到1982年血管炎與中性粒細(xì)胞胞漿成分反應(yīng)的自身抗體之間的關(guān)系才被明確[2]，人們才意識到ANCA與血管炎相關(guān)。1985年，van der Woude等[3]通過間接免疫熒光的方法在GPA患者中檢測到這種抗細(xì)胞質(zhì)抗體，并把這種細(xì)胞質(zhì)分布的熒光模型稱為C-ANCA。繼C-ANCA之后，有學(xué)者報道了在系統(tǒng)性動脈炎和腎小球腎炎患者中產(chǎn)生核通過IIF方法發(fā)現(xiàn)了圍繞細(xì)胞核周染色模式的自身抗體，即P-ANCA[4-5]。之后IIF得到了更多的關(guān)注與應(yīng)用，一度被認(rèn)為是檢測ANCA的“金標(biāo)準(zhǔn)”。隨著PR3和MPO的發(fā)現(xiàn)，以及蛋白純化技術(shù)的進(jìn)步，針對抗原特異性的檢測也得到快速發(fā)展，包括酶聯(lián)免疫的一、二、三代產(chǎn)品，免疫印跡、熒光酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光、聯(lián)合特異性抗原檢測的IIF，以及高通量的多重微珠免疫法等多平臺、多方法學(xué)，本綜述將介紹不同的檢測方法及其方法學(xué)之間的一致性。

1 ANCA的組成

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體是以中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞胞漿成分為靶抗原的自身抗體，包括人白細(xì)胞彈性蛋白酶（human leukocyte elastase,HLE）、乳鐵蛋白（lactoferrin,LF）、蛋白 酶3（proteinase 3,PR3）、彈性蛋白酶（elastase,ELA）、溶酶體（lysozyme,LYS）、髓過氧化物 酶（myeloperoxidase,MPO）、天青殺素（azurocidin,AZU）、組織蛋白酶G（cathepsin G,Cath G）和殺菌/通透性增高蛋（bactericidal/permeability increasing protein,BPI）等。根據(jù)熒光模型，ANCA靶抗原可以分為胞漿型（cytoplasmic ANCA,cANCA）、核周型（perinuclear ANCA,pANCA）和非典 型（atypical ANCA,xANCA）。cANCA的主要靶抗原為PR3，pANCA的主要靶抗原為MPO。PR3是大小29～30KD弱陽性蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶家族成員之一。PR3的前體酶經(jīng)過4次加工為成熟形式，主要存在于中性粒細(xì)胞的嗜藍(lán)顆粒中；其生理抑制劑為α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin,α1-AT）[6]。抗PR3抗體主要見于韋格納肉芽腫，是其特異性抗體，陽性率占70%～80%，且與病程、嚴(yán)重性和活動性有關(guān)。MPO是由2條重鏈和2條輕鏈組成的二聚體大分子蛋白，分子量150KD，等電點大于11；其生理抑制劑為銅藍(lán)蛋白[7]。pANCA不如cANCA具有診斷特異性，pANCA陽性主要見于特發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN）、顯微鏡下多動脈炎（MPA），在GPA患者中也存在抗MPO抗體。pANCA患者的血管炎病變程度重，常有多系統(tǒng)損害。

2 ANCA的檢測方法發(fā)展

隨著檢測技術(shù)的提高，ANCA的檢測方法向多平臺、多原理發(fā)展，常見的檢測方法包括間接熒光法（IIF）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA，第一代、第二代、第三代等）、化學(xué)發(fā)光（CLIA）、熒光酶免疫吸附法（FEIA）、多重微珠法等。

2.1 間接免疫熒光 間接免疫熒光（IIF）是檢測ANCA最先使用的手段，一般分為乙醇固定和甲醛固定兩種形式。IIF檢測的特點靈敏度高、特異性差；并且IIF主觀性太強(qiáng)，對結(jié)果的判讀需要很強(qiáng)的專業(yè)知識及豐富的經(jīng)驗。隨著對ANCA研究的深入，越來越多的AAV患者被發(fā)現(xiàn)，檢測工作量增加，對人工閱片要求越高。為了滿足市場的需要，商業(yè)化自動閱片系統(tǒng)上市，比如INOVA公司的NOVA View、Medipan公司的Aklides系統(tǒng)、Immuno Concepts的Image Navigator、Euroimmun AG的EUROPattern等。自動閱片排除了人為的主觀性，滿足了工作量的需求。Knütter I等[8]比較了分別用Aklides系統(tǒng)自動閱片與人工閱片GA公司檢測ANCA的乙醇和甲醇固定玻片，為了使主觀性最小化，由兩位經(jīng)驗豐富的研究者進(jìn)行手工閱讀，結(jié)果表明自動閱片與人工閱片一致性高。最近又發(fā)展了一種新型檢測技術(shù)即GA公司的CytoBead ANCA[9]，將乙醇固定的中性粒細(xì)胞與包被純化的PR3、MPO的珠子共同固定在同一個玻片上，乙醇固定的中性粒細(xì)胞位于玻片的中室，包被PR3、MPO的熒光珠子位于右室，其中包被PR3的是9μm的紅色熒光珠子，包被MPO的是15μm的紅色熒光珠子，這種檢測技術(shù)提高了ANCA檢測特異性。

2.2 第一代ELISA自從明確了cANCA、pANCA的靶抗原，一些實驗室從中性粒細(xì)胞中純化PR3、MPO蛋白，開始制備抗原特異性檢測[10]。第一個商用ELISA試劑盒于1990年問世[11]，隨后出現(xiàn)了很多ELISA廠家。這些ELISA檢測技術(shù)原理將PR3/MPO蛋白直接物理吸附包被于微孔板中，被稱為第一代ELISA。由于蛋白純化技術(shù)不同，各個廠家檢測結(jié)果差別較大且與IIF結(jié)果缺乏可比性[12]。此外，抗原直接吸附于微孔板造成抗原變形及表位遮掩，導(dǎo)致檢測結(jié)果靈敏度差，造成漏檢。

2.3 第二代、三代ELISA基于第一代ELISAs低敏感性的原因，蛋白質(zhì)修飾新方法和不同的檢測方法快速發(fā)展。所謂的第二代ANCA ELISA檢測使用捕獲分子（主要是抗體）與微孔板結(jié)合，抗原特異性結(jié)合固相上的抗體，這樣可減少抗原的空間位阻，使表位盡可能地暴露，另外減少因抗原與固相直接結(jié)合導(dǎo)致的表位結(jié)構(gòu)改變[13-14]。研究表明[13,15-16]，捕獲法的靈敏度增加，并優(yōu)于直接包被。主要廠家為歐洲診斷。第三代ELISA類似于第二代，為了充分暴露抗原表位，抗原在結(jié)合ELISA板時，利用錨定技術(shù)固定抗原[17-19]。抗原通過附著在ELISA平板表面的錨定分子與ELISA平板表面結(jié)合。與IIF相比，該方法提供了更好的表位可獲得性，從而進(jìn)一步提高了敏感性和特異性。Roggenbuck D等[19]分別用第一代、第二代、第三代ELISAs檢測86例GPA患者、450例其他疾病和80例健康者，比較三代檢測的特異性和靈敏度并繪制ROC曲線，得到的AUC分別為0.80（第一代，95%置信區(qū)間：0.76～0.83）、0.86（第二代，95%置信區(qū)間：0.82～0.89）和0.96（第三代，95%置信區(qū)間：0.94～0.98）。主要廠家為法迪亞EliA系統(tǒng)。

2.4 其他ELlSA利用直接包被微孔板原理進(jìn)行PR3 ELISA檢測時，有一種新方法是歐蒙公司開發(fā)的，即使用人天然和重組PR3抗原混合包被[20]。該研究表明[21-22]，這可能比第一代間接法和第二代捕獲法具有更高的靈敏度；然而，這并未在所有的研究中得到證實。

2.5 化學(xué)發(fā)光法 上世紀(jì)70年代中期，Arakawe首先報道了化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescence immunoassay,CLIA），發(fā)展至今已成為一種成熟的、先進(jìn)的超微量活性物質(zhì)檢測技術(shù)，應(yīng)用范圍廣泛。然而，ANCA化學(xué)發(fā)光檢測是近幾年才發(fā)展起來的。國外化學(xué)發(fā)光檢測有INOVA的BIO-FLASH系統(tǒng)和A.Menarini公司的Zenit RA系統(tǒng)；國內(nèi)化學(xué)發(fā)光廠家主要有蘇州浩歐博、深圳亞輝龍、北京中航賽維、蘇州長光華醫(yī)。以INOVA的QUANTA Flash Lite?為例探討一下化學(xué)發(fā)光法：純化的抗原以共價鍵的方式化學(xué)連接到磁珠表面的官能團(tuán)上，加入稀釋后的樣本與磁珠上的抗原反應(yīng)，洗去未結(jié)合的非特異性抗體；加入帶有標(biāo)記的二抗孵育，加入底物收集并檢測光信號。一項涵蓋9個國家11個實驗室的大型多中心研究證明，CLIA有高靈敏度和特異性[23]；在另一項研究中使用新開發(fā)的抗MPO抗體CLIA與三種不同的商用MPO檢測法相比，CLIA法有相對較高的敏感性、特異性ROC曲線AUC面積0.96（95%置信區(qū)間：0.90～1.00）[24]；國內(nèi)一項研究比較浩歐博化學(xué)發(fā)光與歐蒙ELISA之間的符合率，PR3-ANCA陽性符合率35.1%、陰性符合率96.1%、總符合率86.8%；MPO-ANCA陽性符合率81.9%、陰性符合率98.8%，總符合率93.8%[25]。

2.6 多重微珠免疫法 多重微珠免疫法（bead-based multiplex immunoassays,MBA）采用Luminex技術(shù)，其工作原理為：①編碼微球，用不同配比的兩種熒光染料將直徑5.6μm的聚苯乙烯微球染成不同熒光色，從而獲得多達(dá)100種不同熒光編碼的微球；②把針對不同待測物質(zhì)的蛋白以共價交聯(lián)的方式結(jié)合到特定編碼的微球上，每個編碼微球都對應(yīng)相應(yīng)的檢測項目；③把針對不同待測物的熒光編碼微球混合，然后加入待測物，形成的復(fù)合物在與標(biāo)記熒光素結(jié)合反應(yīng)；④微球成單列通過兩束激光，一束判定微球的熒光編碼，另一束測定微球上的熒光素的熒光強(qiáng)度。使用多重微珠免疫法檢測ANCA的主要廠家有宙斯（Zeus）的AtheNA Multi-Lyte?和伯樂（Bio-Rad）Bio-Plex?2200。2009年伯樂公司評價Bio-Plex?2200，在一個反應(yīng)里可以同時檢測ANCA三個項目（PR3、MPO、GBM），且具有相對較好的靈敏性和特異性[26]。另一項研究比較了Bio-Plex?2200與INOVA QUNATA Lite，MPO-ANCA符合率為70.4%（n=81；95%置信區(qū)間：59.7%～79.2%），PR3-ANCA符合率為76.5%（n=81；95%置信區(qū)間：66.2%～84.4%）[27]。

2.7 其他方法 除上述方法外，檢測ANCA方法還有斑點/線性免疫印跡法、側(cè)向?qū)游鰴z測（LFA）、可尋址激光珠免疫分析法（ALBIA）等。根據(jù)不同固定及標(biāo)記工藝，每種方法均有各自特點。

3 總結(jié)

IIF作為發(fā)現(xiàn)ANCA的檢測方法，在早期檢測中占有優(yōu)勢地位，長期以來被人們當(dāng)作檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。1999年國際共識中提到疑似ANCA首先用IIF進(jìn)行篩選，再用抗原特異性檢測確認(rèn)[28]。由于IIF的特異性差，抗原純化技術(shù)的提高，抗原特異性檢測技術(shù)快速發(fā)展。1990年第一個商業(yè)化ELISA試劑盒上市，即為第一代ELISA。但其特異性好、靈敏度低，漏檢情況嚴(yán)重。為解決這一問題，之后自身抗體廠家開發(fā)了“超敏”試劑盒以提高檢出率。1998年以歐洲診斷為主的捕獲法ELISA，2005年以法迪亞為主的熒光酶免疫法（FEIA）、2007年以法迪亞為主的錨定ELISA法、2012年化學(xué)發(fā)光法還有最近發(fā)展的多重微珠法等，相比第一代ELISA靈敏度和特異性均有提升。隨著抗原特異性靈敏度的提高，2017年重新修訂了國際共識，共識建議GPA、MPA患者可以直接用高質(zhì)量的特異性檢測ANCA（第二、三代ELISA、化學(xué)發(fā)光法、FEIA、多重微珠）[29]。然而，有些實驗室檢測ANCA已經(jīng)排除IIF，其實這是對共識的誤解。

多平臺多方法的聯(lián)合使用，是提高ANCA檢測準(zhǔn)確性的必要手段。但由于抗體的異質(zhì)性、各廠家使用的抗原及標(biāo)記的不同，各個廠家檢測結(jié)果差別較大。盡管美國CDC發(fā)布了參考血清（PR3-ANCA Human Reference Serum #16、MPO-ANCA Human Reference Serum#15），2016年開始也有參考物質(zhì)（MPO：ERM?-DA476/IFCC[30]和PR3：ERM?-DA483/IFCC[31]），可能各廠家的溯源標(biāo)準(zhǔn)不一致，檢測結(jié)果仍然不一致。雖然聯(lián)合檢測是必要手段，但仍不能確定哪種方法、哪個廠家檢測最為科學(xué)、準(zhǔn)確。目前統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)是ANCA檢測急需解決的問題。