傳統食醋釀造中微生物的研究進展

程荷芳

上海太太樂食品有限公司（上海 201800）

食醋為我國傳統的酸性調味品和保存劑，與人們的日常生活息息相關。傳統的釀造技術多采用固態或半固態發酵工藝，在開放或半開放式的環境下，通過微生物群落的盛衰交替和協同作用釀制食品的過程[1-3]。國內食醋主要以谷物醋為主，采用谷物為原料，以加入大曲的方式引入多種微生物和酶，通過復雜的糖化、酒精發酵和醋酸發酵等過程而制得[4-5]。霉菌、酵母和醋酸菌屬是食醋生產過程中的主要微生物。

食醋除作為酸性調味品和保存劑，還有其他生理作用。已開展研究的食醋功能主要有殺菌抗菌、促進食欲、緩解疲勞、降低血糖、降血壓、減肥、美容美顏、抗癌防癌等[6]。Beh等[7]研究表明，醋酸菌產生以醋酸為主的有機酸，對高脂飲食誘導的肥胖小鼠具有良好的抗肥胖和抗炎活性。

食醋釀造是一個復雜的生化和微生物作用的過程，在微生物學研究領域，99%以上的微生物都未（難）被純培養的，這對于具有高度物種多樣性的傳統釀造食品食醋而言，進一步了解其微生物群落結構和功能具有更大挑戰[8]。隨著分子生物學技術的快速發展，傳統釀造食品微生物群落結構的研究不僅僅局限于傳統的可分離培養微生物研究[9]。高通量測序技術的更新、測序成本的降低及測序通量的擴展等優勢不斷加強，為直接分析群落中全部微生物的種群組成、分布及其動態演替提供了有利的技術支撐[10-12]。宏基因組測序技術不僅提供更為豐富的微生物物種的基因信息，而且還能有效提高檢測效率和結果準確性，為研究者更全面地解析微生物群落結構、變化規律并挖掘潛在的功能基因提供契機，從而得以進一步開展對傳統釀造食品的深入探索[13]。

通過綜述利用高通量測序及宏基因組測序技術等前沿技術對傳統食醋釀造中的微生物進行檢測研究，并分析討論其面臨的主要問題和發展趨勢，為傳統釀造食醋的科學研究和工業化生產提供相關理論基礎。

1 大曲中主要微生物研究

大曲是以大麥、小麥或豌豆混合物為原料，經粗粉碎，加入一定量的水后壓制成磚狀曲坯，人工控制在一定的溫度、濕度條件下經過一段時間培養而成的粗酶制劑[14]，食醋大曲的生產環境相對開放，其環境、原料及器具中的微生物均可能溶入大曲體系中，使其集聚了食醋釀造所老古板大部分微生物。為傳統的固態發酵如食醋、白酒釀造等過程提供了重要的菌系、酶系和物系。大曲中微生物群落多樣，由多種細菌、酵母菌和霉菌等組成。霉菌中最重要的是曲霉菌和根霉菌[15]。

Zheng等[16]利用傳統可培養手段從汾型大曲中分離鑒定190株菌株，其包含109種細菌及81種酵母和霉菌。Wang等[17]通過PCR-DGGE方法在中國白酒釀造使用的大曲中檢測到米黑根毛霉、布氏犁頭霉、米曲霉、土曲霉等霉菌。PCR-DGGE即polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis的縮寫，是一種聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術，它無需純培養，能鑒定出豐度較高或參考數據庫中可供參考的基因信息，從而可更全面地了解不同發酵階段的微生物群落組成[18]。蘭玉倩等[19]通過PCR-DGGE指紋技術，分析清香型大曲在制作過程中真菌類的群落演替規律，共檢測到畢赤酵母屬（Pichia kudriavzevii）、東方伊薩欽基氏菌（Issatchenkla orientalis）、球囊菌門（Glomeromycota）、酵母屬（Saccharomyces cerevisiae）、酵母菌屬（Saccharomycopsis fibuligera）、地霉（Geotrichum）和根霉屬（Rhizopus oryzae）7個真菌分類屬微生物。Li等[20]采用高通量測序技術對大曲中細菌和真菌微生物種類及豐度進行分析，每克大曲樣品OTU（operational taxonomic unit）（97%）在600以上，對微生物多樣性的分析非常有效。李申奧[21]以兼香型白云邊酒高溫大曲不同發酵階段9個樣品為研究對象，利用高通量測序技術對發酵過程中大曲的微生物群落進行分析，細菌群落16S rDNA擴增子測序分析結果表明，樣品OTUs數量在進入培菌期后先劇烈下降，后快速上升，又再次下降與回升，進入儲藏期后持續下降；所有樣品中共獲得117個OTUs分類，優勢菌屬是糖多孢菌（Saccharopolyspora）、嗜熱放線菌（Thermoactinomyces）、未分類的嗜熱放線菌（Unclassified Thermoactinomycetaceae）和乳酸桿菌（Lactobacillus）；真菌群落ITS擴增子測序分析結果表明，樣品OTUs數量在整個發酵過程中呈現先下降后回升再下降再回升的變化走勢；所有樣品共獲得82個OTUs分類，優勢菌屬是嗜熱菌（Thermomyces），曲霉菌（Aspergillus）和念珠菌（Candida）；相鄰時間樣品的細菌和真菌群落組成相似。

Nie等[22]通過高通量PCR-DGGE測序技術，研究山西老陳醋大曲中的細菌菌群結構和真菌菌群結構，研究發現山西老陳醋大曲中的主要細菌菌群結構主要包括糖多孢菌（Saccharopolyspora）、葡萄球菌（Staphylacocca）、芽孢桿菌（Bacillus）、鏈霉菌屬（Straphonyces）、魏斯氏菌屬（Weisseria）、乳酸菌屬（Lactobacilus）、泛菌屬（Pantoea）、醋酸菌屬（Acetobacter）、單胞菌屬（Monomonas）、高溫放線菌屬（Thermoactinomycetes）、糖單胞菌屬（Saccharomonas）、假單胞菌（Pseudomonas）、短小桿菌屬（Brevibacterium）、短桿菌屬（Brevibacterium）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）等。真菌菌群結果有復膜孢酵母屬（Polycystis）、曲霉菌屬（Aspergillus）、畢赤酵母屬（Pichia）、紅曲霉（Monascus）等。

大曲中的微生物群落通過PCR-DGGE指紋、高通量測序及16S rDNA測序等技術，更好更全面地分析大曲中的微生物群落組成和分布情況，但各微生物在大曲中的主要作用、如何作用，對食醋的風味貢獻是正向還是負向的，仍有待進一步探索和研究。

2 醋酸發酵過程中的微生物研究

中國的四大名醋，即山西老陳醋、鎮江香醋、四川麩醋及福建永春老醋風味各有特色，除其工藝差異，另一個核心就是與醋酸發酵過程中的微生物有很大關系。下面重點綜述醋酸發酵過程中的微生物研究現狀。

劉廷銳[23]利用二代基因測序技術探究四川麩醋醋酸發酵過程中細菌菌落的多樣性。分析表明在整個醋酸發酵過程中，通過Shannon和ace指數的變化表明發酵初期細菌種類最為豐富，隨著發酵的進行，豐富度和多樣性開始降低，在末期又處較高位置。乳桿菌屬和醋桿菌屬在發酵過程中呈優勢菌屬。此外還有一些豐度較低但伴隨整個發酵過程的如葡萄糖桿菌屬，假單胞菌屬和芽孢桿菌屬等。

陶京蘭等[24]利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應RT-FQPCR技術監測鎮江香醋醋酸發酵過程中微生物的變化情況，并證實醋醅中的微生物主要為醋酸菌、乳酸菌和酵母菌屬，三者在細菌和真菌總和占比中超過80%。RT-FQPCR技術是一種通過監測PCR過程中所加入熒光基團的熒光信號，利用已知濃度的標準品繪制標準曲線，并對未知樣品進行定量分析的一種核酸定量技術[25]。通過RT-FQPCR技術監測鎮江香醋醋酸發酵過程，對醋酸發酵階段醋醅中的總細菌數、總真菌數、醋酸菌、乳酸菌和酵母菌的動態變化進行定量分析，這對于食醋發酵過程中的控制及提高產品的風味具有重要的生產意義。

牟俊[26]利用高通量測序方法重點分析山西老陳醋發酵階段乳酸菌和醋酸菌的組成和演替規律，結果顯示醋酸發酵過程中，乳酸菌的豐度逐漸降低，而醋酸菌的豐度逐漸增加，共檢測到5種乳桿菌，占乳酸菌豐度的98%，瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）占乳桿菌豐度的55%，是最主要的乳酸菌。共檢測到12種醋桿菌，占醋酸菌豐度的95%，其中巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）占醋桿菌豐度的70%，是最主要的醋酸菌。通過轉錄組學對其相互作用機制進行初步解析，為深入了解山西老陳醋發酵過程中的釀造機理提供理論。

王俊奇等[27]利用Illumina Miseq高通量測序技術，分別以16S rRNA和18S rRNA基因為分子標記，對醋酸發酵過程中、1個月成品、1年陳釀和10年陳釀4個主要品質的永春老醋中細菌與真菌群落多樣性動態變化進行分析，結果表明，醋酸發酵過程中1個月成品、1年陳釀中的優勢細菌皆為α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）和芽孢桿菌綱（Bacilli），屬水平以醋酸桿菌屬（Acetobacter＞60%）和乳桿菌屬（Lactobacillus＞20%）為優勢菌，10年陳釀產品中未檢測到16S rRNA基因；真菌類群方面，四者皆以酵母綱（Saccharomycetes）和散囊菌綱（Eurotio-mycetes）為優勢真菌綱。

聶志強等[28]應用宏基因組測序技術對天津獨流老醋醋酸發酵過程中的群落變化研究中發現，在醋酸發酵過程中，醋醅中相對豐度較低的細菌（相對豐度0.01%以上）也發生著較大的變化。其中，類諾卡氏菌屬（Nocardioides）的相對豐度呈上升趨勢，在末期相對豐度達到0.06%，說明其具有較強的醋酸耐受性。假單胞菌屬（Pseudomonas）隨著醋酸發酵的進行，其相對豐度從0.14%下降到0.04%后逐漸消失，醋酸對假單胞菌屬的影響較大。另外，埃希菌屬在發酵前期到中期呈增加趨勢，克雷伯菌屬僅出現在發酵末期。整個發酵周期中，相對豐度＞0.01%的細菌達10種，食醋固態釀造過程中來源于樣品和環境中的多種微生物能自發地繁殖、富集，也是傳統食醋風味豐富的主要原因。

Wu等[29]采用宏基因組測序技術對香醋的微生物群落結構和功能微生物進行研究，進而了解與食醋風味相關的微生物菌群。結果顯示，食醋中細菌、真核生物和古細菌的相對豐度分別為91.75%，0.19%和8.06%。此外，共有來自951屬細菌的蛋白編碼基因被鑒定出來，其中42.3%與代謝通路相關、28.3%與遺傳信息相關、10.1%與環境信息相關。食醋的風味研究結果表明，乙偶姻是在醋酸發酵過程中提高香醋風味的重要物質，其合成受多種代謝途徑的調控[30]。

Lu等[31]通過宏基因組測序技術，在物種水平上揭示乙偶姻代謝途徑中微生物分布的差異性。乙偶姻代謝途徑主要是在乙酰乳酸合酶和乙酰乳酸脫羧酶共同調控下完成。乙酰乳酸合酶主要由布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri，21.0%）和巴氏桿菌（A.pasteurianus，29.3%）產生；而布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri，26.5%）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri，11.6%）、巴氏桿菌（A.pasteurianus，5.6%）、發酵乳桿菌（L.fermentum，3.2%）和短乳桿菌（L.brevis，2.8%）參與乙酰乳酸脫羧酶的合成代謝。雙乙酰是合成乙偶姻主要的前體物質，巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）和4種乳酸菌，包括布氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、發酵乳桿菌和短乳桿菌是醋酸發酵過程中促使雙乙酰向乙偶姻轉化的功能微生物菌種。

Nei等[32]應用宏基因組測序技術在傳統食醋中首次發現相對豐度低于0.1%的念珠藻屬（Nostoc），類諾卡菌屬（Nocardioides），丙酸菌屬（Propionibacterium），克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和片球菌屬（Pediococcus）。此前通過人工培養方式，僅能分離鑒定出食醋在發酵過程中的醋酸菌（主要包括醋桿菌屬、葡萄糖桿菌屬和葡萄糖醋酸桿菌屬）、乳酸菌（主要包括乳桿菌屬和乳球菌屬）和芽孢桿菌屬[33]，宏基因組測序技術大幅提高微生物菌種的覆蓋率。

3 結語與展望

通過PCR-DGGE指紋、高通量測序及16S rDNA等測序，不同的大曲檢測出的微生物群落分布有差異，大曲中的微生物群落發現大曲中有100余種細菌及80余種真菌；其中細菌菌群結構主要包括糖多孢菌、葡萄球菌（Staphylacocca）、芽孢桿菌、鏈霉菌屬（Straphonyces）、魏斯菌屬、乳酸菌屬（Lactobacilus）、泛菌屬（Pantoea）、醋酸菌屬（Acetobacter）、單胞菌屬（Monomonas）、高溫放線菌屬（Thermoactinomycetes）、糖單胞菌屬（Saccharomonas）、假單胞菌、短小桿菌屬、短桿菌屬、不動桿菌屬、鞘氨醇單胞菌等；真菌菌群主要有復膜孢酵母屬、曲霉菌屬、畢赤酵母屬、紅曲霉、黑根毛霉、布氏犁頭霉、米曲霉、土曲霉等霉菌。

利用二代基因測序、RT-FQPCR技術、高通量測序等技術，研究發現醋酸發酵過程的微生物菌屬主要優勢菌屬為乳酸菌屬、醋酸菌屬及酵母菌屬和芽孢桿菌屬，醋酸菌屬主要包括醋桿菌屬、葡萄糖桿菌屬和葡萄糖醋酸桿菌屬，乳酸菌屬主要包括乳桿菌屬和乳球菌屬。通過宏基因組測序技術，研究發現醋酸發酵過程的乙偶姻代謝途徑主要是在乙酰乳酸合酶和乙酰乳酸脫羧酶共同調控下完成。而這2種酶是由以下幾種微生物生成布氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、發酵乳桿菌和短乳桿菌[34]。

傳統食品食醋種類繁多，風味各異，大部分仍沿用傳統的微生物生產工藝，其質量的穩定性與微生物的多樣性密切相關。利用先進的分子生物學技術對微生物菌群的研究可為食醋的發酵機理和代謝過程做出重要解析。隨著高通量測序技術、PCR-DGGE等生物技術與生物數據庫、智能信息化技術的深度結合，最終將實現對傳統發酵食品食醋發酵機制的全方位解析，從而推動傳統發酵過程的現代化與智能化升級。