木耳多糖提取分離純化、結構表征及生物活性研究進展

殷紅，趙時荊，韓姍姍，高其芳，鞏超黨，張強*

1. 陜西省生物農業研究所（西安 710043）；2. 柞水中博金米菌業發展有限公司（商洛 711400）

食用菌是一大類食品，具有獨特的滋味和風味，其中黑木耳又是常見的一種食用菌。黑木耳（Auricularia auricular）又叫木耳、木蛾、黑菜、云耳、丁楊，擔子菌門，木耳屬、木耳科，是一種珍貴的藥食同源膠質真菌[1]。木耳資源大約占全世界的90%，中國和日本是木耳的主要產地。我國木耳主要集中在東北和秦嶺。黑木耳富含豐富的營養成分，如蛋白質、木耳多糖、礦物質及維生素等，木耳多糖占木耳的65%，也是木耳主要的生物活性成分。木耳多糖有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、抗衰老、降血脂、增強免疫力等多種生物功效。木耳多糖的活性成分與其結構密切相關，包括單糖組成、官能團和糖苷鍵連接方式等都對活性有著不同的影響。20世紀70年代末到80年代Sone等[2]和Misaki等[3]研究發現黑木耳多糖中含有β-D-葡聚糖和酸性雜多糖，β-D-葡聚糖有水溶性和水不溶性2種。2種β-D-葡聚糖糖苷鍵連接類型一樣都是由β-（1→3）-糖苷鏈連接而成的，但取代基不同。近年來對木耳多糖的研究主要集中在提取工藝上，對木耳多糖的結構研究越來越受到重視。對結構表征和生物活性的影響離不開多糖的提取工藝，其主要的營養調節機制也成為未來開發新產品的主要研究方向。文章主要對黑木耳多糖的提取分離純化、結構分析及生物活性現狀進行綜述，為木耳多糖在食品深加工及生物醫學領域提供參考。

1 提取與分離純化

1.1 木耳多糖的提取

1.1.1 熱水浸提法

多糖的提取最常見的方法是熱水浸提法。由于熱水浸提法具有操作簡單、成本低等特點，常被大家所采用，多糖是易溶于水，但木耳本身高黏度、易吸水等特性，導致木耳多糖提取上的料液比大而操作困難，其耗時長。張海燕等[4]對黑木耳多糖提取工藝進行優化，得出在溫度100 ℃、液料比1∶70（g/mL）、提取時間4 h時，黑木耳多糖提取率可達到42.56%。張婧涵等[5]研究桑木耳多糖提取工藝，在溫度100℃、料液比1∶108（m/V）、時間3.5 h時桑木耳多糖提取率達6.96%，但重復提取10次后，多糖總得率升高到34.18%。木耳多糖熱水浸提法提取溫度一般在70℃以上，料液比根據木耳種類不同，適時調節，進行重復浸提，提取率在30%以上。在提取工藝中，溫度和時間是至關重要的影響因素，影響著多糖的結構穩定性和生物活性，所以水提法提取多糖過程中應控制好工藝的各個影響因素。

1.1.2 超聲波提取法

超聲波提取是采用超聲波輔助溶劑進行提取，通過聲波產生高速、強烈的空化效應和攪拌作用，破壞細胞壁，使胞內物質得到釋放，溶劑滲透到細胞中，使得木耳多糖更快地溶出，從而縮短提取時間，提高提取率。因此超聲波提取多糖具有提取時間短、提取效率高的優點。與熱水浸提法比，超聲波提取得到的多糖分子三螺旋結構不被破壞而更加完整地被保留，但超聲波提取在時間上有局限性，不宜過長，否則多糖分子會斷裂，從而降低提取率且成本較大[6]。吳玉柱等[7]以玉木耳為原料，采用超聲波輔助法提取多糖，在功率210 W、液料比40∶1 mL/g、溫度62 ℃、時間29 min條件下，多糖的得率為7.43%。馬昱陽等[8]采用超聲波輔助酶提取毛木耳多糖，當液料比40∶1（mL/g）、超聲波功率160 W、超聲波時間31 min、復合酶酶解溫度64 ℃時，多糖提取率為14.41%。

1.1.3 酶解提取法

酶解提取法是將各種酶添加到料液中，如蛋白酶、果膠酶、纖維素酶等，酶的作用使物質細胞壁破裂，胞內物質流出，從而使多糖會更快地溶出到胞外，提高提取率。酶解提取操作簡單，提取率較高，多糖的結構不被破壞，但為了保持酶活性，對提取溫度和pH有一定的局限性，所以在操作中要嚴格控制。黃藝寧等[9]在提取溫度50.2 ℃、纖維素酶添加量3 774 U/g、pH 4.9、提取時間135 min條件下，得到15.47%白背毛木耳子實體多糖的提取率。

1.1.4 微波提取法

微波提取法是利用一定強度的電磁波把能量傳播到組織內部，在外加電場下使組織內部的分子擺動加速，產生摩擦，使溫度升高、壓力增高，加速組織裂解和細胞破裂，促進多糖提取。林花等[10]以水為提取劑，料液比為1∶40，微波功率為800 W，浸提溫度為95 ℃，微波輻射時間為40 min，再用水浴浸提法提取，第一次加水400 mL、1.5 h，第二次加水500 mL、1.5 h，浸提2次，多糖提取率為19.30%。微波提取法在生產中可以節省成本，又節能、安全、高效。

綜上所述，木耳多糖的提取方法主要有熱水浸提法、超聲波提取法、酶解提取法、微波提取法或幾種聯用，不同的提取方法其多糖的提取率也有所不同，不同產地品種的木耳其提取率也不盡相同，所以在木耳多糖提取中要綜合考慮各方面因素，最終選擇合適的方法進行后續試驗。此外，還有一些利用高壓均質法、超聲波協同半仿生法、超高壓微射流等提取木耳多糖，如：郝慧敏等[11]采用超聲波協同半仿生法提取黑木耳多糖的工藝，料液比1∶30（g/mL），超聲溫度60 ℃，超聲功率500 W，超聲時間 60 min時，黑木耳多糖提取率為22.52%；秦令祥等[12]采用動態超高壓微射流技術提取黑木耳多糖，其最佳工藝條件為提取時間2 h、料液比1∶40（g/mL）、微射流壓力140 MPa、提取溫度90 ℃，黑木耳多糖得率為22.13%；孔沛筠等[13]采用高溫蒸汽浸提木耳多糖，料液比1∶50（g/mL）、提取溫度120 ℃，提取時間85 min，此時多糖得率為48.38%±1.64%。在多糖提取過程中，為不破壞其結構和生物活性，建立一種快速、高效、得率高、活性好、成本低的木耳多糖提取方法有待研究者進一步研究。

1.2 木耳多糖分離純化

木耳中的多糖溶于水后，需分離除去蛋白質等其他大分子而達到單純的木耳多糖。木耳經提取后得到的是粗多糖，還含有蛋白質、脂肪、色素等大分子物質，為了獲得單一的純多糖組分，必須除去粗多糖中一些非糖成分及雜質后再進一步分離純化，所以進行脫蛋白、脫脂或脫色處理是必要的步驟。

脫蛋白的常用方法主要有Sevage法、三氟三氯乙烷、鞣酸法、三氯乙酸法、聚酰胺吸附法和酶解法。

木耳提取液中蛋白脫除后還有約1.2%的粗脂肪，根據相似相溶原理，一般采用有機溶劑脫除，如石油醚，也可采用超臨界脫脂法。木耳提取液經過脫蛋白、脫脂處理后，溶液顏色較深，有時還需進一步脫色。常用的是活性炭吸附、大孔樹脂吸附及過氧化氫氧化。活性炭脫色在吸附中會損失多糖，與其他兩種脫色方法比較大孔樹脂吸附更常用，對多糖損耗也較小。其他的一些小分子化合物通過透析、超濾等方法可以去除[14]。

經過上述分離處理之后得到的粗多糖還需進一步純化處理，為后續研究多糖的組成、結構等奠定基礎。常用的純化方法有柱層析法、沉淀法和膜分離法。王理文[15]采用超聲提取法對玉木耳進行了粗多糖的提取，并用Sevage法除去蛋白質后，用DEAEcellulose-52柱分離出純化后的玉木耳多糖，其得率為487.23±12.23 mg/g。許海林[16]將2種黑木耳多糖AAP-10和AAP-80進行分離純化，進行DEAE-52離子交接層析分離純化，用不同濃度的NaCl溶液洗脫2種黑木耳多糖，結果發現在去離子水、0.3%和1.5%濃度的NaCl溶液洗脫過程出現洗脫峰，且以1.5%濃度的NaCl溶液洗脫的為主峰，收集此組分，命名為AAP-10-Ⅲ和AAP-80-Ⅲ。對2種黑木耳多糖組分（AAP-10-Ⅲ和AAP-80-Ⅲ）進行Sephacry1TMS-400HR凝膠層析柱分離，結果發現2種黑木耳多糖組分均一，命名為AAP-10-Se和AAP-80-Se。王銀平[17]使用DEAE-纖維素DE-52離子交換柱和Sepharose CL-6B凝膠柱對玉木耳多糖進行分離純化，得到ACPN-1a，ACPN-1b，ACPA-1a，ACPA-1b，ACPA-2a。多糖的分離純化很復雜，所以通常選用2種或者2種以上的方法結合，得到純度較高的多糖。

2 木耳多糖結構表征

多糖是一類結構復雜的大分子物質，多糖結構與生物活性息息相關，對多糖結構表征具有重要的研究意義。要研究木耳多糖的結構，首先要知道多糖的純度、分子量大小，其次確定多糖的單糖組成、糖苷鍵種類，確定糖苷鍵的連接方式。明確結構中哪些鍵影響著多糖的性質。

2.1 木耳多糖純度鑒定及分子量的測定

木耳多糖的純度一般采用比旋光法和凝膠色譜法測定。比旋光度法是根據化學結構來判定，相同結構的多糖具有相同的旋光性。若某個多糖樣品在純化前后旋光度沒有變化，可認為是均一多糖。凝膠色譜法采用HPLC，通過凝膠柱檢測樣品，形成的峰形為對稱的、單一的峰，則說明多糖為單一組分。

多糖的分子量大小一般從幾千萬到百萬以上，用不同的方法測定多糖分子量也不盡相同。多糖分子量分布比較分散，分子量的表征有采用HPLC測定的平均分子量Mp，滲透壓法測定的數均分子量Mn，光散射法測定的重均分子量Mw等。木耳多糖相對分子質量在20～3 000 kDa之間。

2.2 木耳多糖結構分析

多糖的結構分為一級結構和高級結構。確定木耳多糖的結構，要明確木耳多糖一級結構的相對分子質量、單糖組成、糖苷鍵類型及糖苷鍵連接方式。木耳多糖的相對分子量的測定通常采用高效凝膠滲透色譜法和高效液相凝膠色譜法。多糖的單糖組成及結構決定著其生物活性。所以對多糖的結構鑒定首要知道其單糖組成，多糖的單糖組成檢測首先利用TFA將糖降解為單糖，由于缺少紫外吸收和熒光吸收基團，需對多糖進行衍生化處理之后再運用高效液相色譜法、氣相色譜法、紙層色譜、薄層層析色譜、氣質聯用等測定。通過傅里葉變換紅外光譜，檢測吡喃環或呋喃環形式。常用高碘酸氧化法、還原裂解、Smith降解和乙酰化方法判斷糖苷鍵位置和相鄰單糖基的連接方式。對木耳多糖的高級結構研究還比較少，常采用X射線衍射法、核磁共振技術、圓二色譜法、熒光分析法等，分析多糖的三維結構和構象。

木耳多糖單糖組成主要包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖還含有少量巖藻糖和阿拉伯糖。Sun等[18]從毛木耳子實體中提取得到的多糖單糖組成主要有葡萄糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖醛酸。Xu等[19]從黑木耳中分離純化出的水溶性中性多糖為β-（1→3）-D-glucan，含有β-（1→6）-D-Glcp側鏈；4個多糖組分的多糖純度幾乎都達到90%以上，且不含核酸和蛋白等；2個中性多糖（ACPN-1a和ACPN-1b）的分子量較大，分別為2.18×106Da和2.07×106Da；ACPA-1a展現較寬的分子量分布（5×105～2×106Da），ACPA-2a 的分子量約為 8.5 ×105Da；2個中性多糖組分（ACPN-1a和ACPN-1b），單糖組成主要都包括葡萄糖（96.17%和95.79%），2個酸性多糖組分（ACPA-1a和ACPA-2a）均為雜多糖，單糖組成主要包括甘露糖（44.85%和56.40%）、葡萄糖（16.17%和1.06%）、葡萄糖醛酸（9.35%和10.89%）、木糖（24.26%和28.52%）和其他少量的單糖。鄢為唯[20]研究的黑木耳多糖進一步純化后單糖組成結果表明AAP1-20僅由葡萄糖（77.82%）組成，AAP1-60含有4種單糖，其中主要是甘露糖（51.91%）與木糖（43.62%），還含有少量的葡萄糖及半乳糖。甲基化分析結果表明，AAP1-20的主要殘基包括1, 4,6-linked Glcp、1, 3, 6-linked Glcp、1, 6-linked Glcp和T-linked Glcp，其中1, 3, 6-linked Glcp含量最高；AAP1-60的主要殘基包括T-linked Galp、1, 3-linked Xylp、1, 4, 6-linked Manp、1, 4-linked Manp和1,6-linked Glcp，其中1, 4-linked Manp含量最高，并且2種組分的分支度都較高。王秀秀[21]研究2種不同方法提取的木耳多糖的單糖組成，主要含有葡萄糖、木糖、半乳糖、巖藻糖和甘露糖。劉茜等[22]采用熱水浸提法提取西北秦巴山區黑木耳多糖，單糖主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖組成，相對摩爾百分比為60.87∶20.83∶9.86。Ma等[23]分離的水溶酸性黑木耳多糖經過氣相-質譜法和核磁共振法分析其結構，由α-（1-3）-甘露聚糖為主鏈，在0-6或0-2位上連接β-D-木糖、β-D-葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸。苗晶囡等[24]提取出一種黑木耳酸性多糖，通過測定發現其是由葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、木糖和半乳糖組成。秦丹丹[25]采用高效液相色譜（HPLC）、凝膠滲透層析色譜（GPC）、紅外光譜（FT-IR）及核磁共振氫譜（1H NMR）分析C-EAAP的結構。試驗結果表明，C-EAAP主要由甘露糖（57.1%）、葡萄糖（22.5%）、葡萄糖醛酸（10.0%）、木糖（6.0%）、半乳糖（2.9%）、巖藻糖（1.1%）和鼠李糖（0.4%）構成。AAP和C-EAAP均含有α、β這2種糖苷構型。

由于木耳產地不同，分類有黑木耳、毛木耳、玉木耳等，對木耳多糖的提取及分離純化的方法也不盡相同，木耳多糖在相對分子量、單糖組成和結構表征上都存在差異。對木耳多糖的單糖組成主要由葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖構成，糖苷鍵連接方式也不同，主要由α、β-D-1, 3-葡萄糖和α、β-D-1, 6-葡萄糖連接。

3 木耳多糖生物活性

黑木耳多糖中含有多種糖組分，國內大量研究表明這些多糖組分具有抗腫瘤、抗凝血、抗氧化、抗血栓、提高免疫力、抗炎抗病毒等多種生物活性功能。木耳多糖的提取工藝和結構特征對其生物活性有很大影響。

3.1 抗腫瘤作用

多糖對腫瘤有抑制作用，從而提高細胞的免疫活性，其原因可能是多糖改變了細胞膜成分，使細胞膜上脂肪酸呈游離狀態，促進細胞膜脂質過氧化，要進一步研究抗腫瘤機制，需要更深入地了解多糖的結構特征。甘霓等[26]研究不同濃度黑木耳多糖對腫瘤細胞增殖和傷痕愈合率的影響。結果表明，黑木耳多糖在體內外都有明顯抗腫瘤作用，與環磷酰胺聯合使用，抑制率隨著多糖的濃度增加而也大大提高。

3.2 免疫作用

免疫活性的高低與多糖的結構也有一定的關系，黑木耳多糖的β構型、多糖的（1→3）、β-（1→6）糖苷鍵有較高的免疫活性。高濃度的木耳多糖，對傷口愈合有促進作用。修飾后的木耳多糖其抗病毒活性也會增加，可作為新型抗病毒藥物的組成。許海林[16]研究2種木耳多糖組分在環磷酰胺免疫抑制小鼠模型中的免疫調節活性。得到的2種多糖組分對小鼠脾臟指數和巨噬細胞的吞噬功能、脾淋巴細胞增殖和NK細胞活性均有所提高，說明這2種木耳多糖組分對免疫細胞都有影響。

3.3 降血糖、血脂作用

研究黑木耳多糖的降血糖、血脂效果，采用正常小鼠和模型小鼠對比，木耳多糖能降低血糖水平，血脂水平。說明黑木耳多糖和酯化后多糖不僅降低血糖值，而且促進葡萄糖轉化為肝糖原，增加肝糖的原合成。通過檢測小鼠血清中低密度脂蛋白（LDL）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和高密度脂蛋白（HDL）4個指標，對LDL、TG、和TC水平有顯著降低，HDL水平有所升高，所以多糖能夠調節血脂[27]。

3.4 抗衰老作用

抗衰老作用可通過檢測自由基清除或者建立小鼠模型，對小鼠血漿、小鼠血清、肝臟及腦中SOD、MDA及GSH-PX進行測定，黑木耳多糖能起到抗衰老的作用[28]。

3.5 抗氧化作用

從黑木耳中分離純化得到不同的多糖組分，通過超氧陰離子和羥基自由基、Fe2+螯合能力檢測木耳多糖的抗氧化活性，研究發現多糖抗氧化活性與其所含糖醛酸的量呈正相關。說明含有糖醛酸的黑木耳多糖濃度越高，其抗氧化活性越強。張磊等[29]采用酶解法提取2種不同的食藥用真菌多糖，均具有清除自由基作用。在同一濃度條件下，木耳多糖清除率優于其他多糖。王秀秀[21]以羥基、超氧陰離子和DPPH自由基清除率及還原力為指標，分析2種木耳多糖的體外抗氧化性活性，結果表明它們都具有一定抗氧化活性。孔沛筠等[13]通過清除試驗、ABTS+·自由基清除試驗及DPPH·清除試驗發現木耳多糖具有良好的天然抗氧化活性。

3.6 抑菌作用

多糖抑菌作用即對病原菌的殺傷能力，不僅要抑制更重要的還要能夠修復調節受損傷的機體，從而提高機體免疫力和對病原菌的防御功能。黑木耳多糖不僅對細菌有抑制，對部分真菌酵母菌也有抑制作用，對霉菌沒有明顯的抑制作用[30]。

4 展望

木耳是一種藥食同源的食用菌，營養豐富、分布廣泛，木耳多糖作為天然的高分子化合物，具有一系列生物活性功能如，提高免疫力、抗腫瘤等。將木耳多糖可作為一種新型藥物開發，替代一些抗生素等藥物來治療疾病，具有廣泛的市場前景。由于木耳本身膠質吸水特性，分子量大，空間結構復雜等特點，在研究木耳多糖方面具有一定的難度。對木耳多糖研究主要集中在多糖的提取工藝和一級結構表征包括單糖組成、分子量大小、糖苷鍵類型和連接方式上，對其高級結構空間結構研究還不夠深入，為進一步明確活性效應機制，探究木耳多糖結構與活性的互作關系，木耳多糖高級結構表征鑒定，增加動物模型確定活體應用下的多糖效果與機制，提高臨床應用等，對開發新型藥物或者功能性食品發揮著至關重要的作用。

5 結語

木耳多糖屬于大分子物質，結構復雜，本身有著高吸水性和膠質性，所以選取合適的提取工藝有利用提高木耳多糖的得率。此次研究為木耳多糖的深加工及產業提供理論參考，推動小木耳、大產業的發展。