食品中單增李斯特菌檢驗技術研究進展

敖威華，李菁雯，陳林軍，趙治國，劉丹，崔強*

1. 呼和浩特海關技術中心（呼和浩特 010020）；2. 二連海關技術中心（二連浩特 021600）

隨著生活水平的大幅提高，人們對食品質量的要求也越來越高。食品質量在人們生活中所占比重逐步增加。打造質量強國戰(zhàn)略，食品行業(yè)在快速發(fā)展，規(guī)模也在不斷地擴大，而在發(fā)展過程中，食品安全問題也在逐年增加，尤其是食源性病原微生物的頻發(fā)，嚴重威脅我國食品行業(yè)的發(fā)展。微生物檢驗作為一項重要的技術手段，為保障食品安全提供強有力的科學依據。我國對于食品中單增李斯特菌的檢測和鑒定仍停留在傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、鑒定和血清型等GB 4789.30—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》描述的檢測方法上?，F有檢測方法通常是培養(yǎng)法，但采用該方法也有很多的弊端，如檢測靈敏度不高，對目標菌和雜菌的檢測容易漏檢，此外對于檢測結果中菌類計數會因不同檢測人員不同的計數方法會有差異。這些方法不僅需要時間長、操作繁瑣，而且特異性不強、靈敏度也不高。因此，從食品安全現狀和食品微生物檢測技術等關鍵問題出發(fā)，建立符合我國國情的食品安全檢測體系，可有效控制和預防食源性致病菌的傳播、發(fā)展。

食品微生物檢驗技術的發(fā)展和應用成為大勢所趨，尤其是食品安全檢測部門更加注重其發(fā)展?jié)撃堋Ｊ称肺⑸餀z測方法為食品的安全提供強有力的科學依據。食品微生物的檢測關系著食品的安全，而食品安全又關系著人體健康。因此，食品微生物檢測是關乎食品安全的關鍵因素。食品中單增李斯特菌的檢測是衡量食品衛(wèi)生與安全的重要指標之一，也是判定被檢食品能否適用的科學依據之一；通過食品中單增李斯特菌的檢測，可以判斷食品加工環(huán)境及衛(wèi)生情況，對食品被致病微生物污染的程度作出正確的評價，為各項食品安全管理工作提供科學依據；對食品微生物檢驗可有效預防或減少食物中毒和人畜共患病的發(fā)生；對提高產品質量、避免經濟損失、保證出口等方面在政治和經濟上都具有重大意義。

1 微生物檢測的常規(guī)方法

多年來，對于食品中單增李斯特菌的檢測通常采用GB 4789.30—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》中的平板培養(yǎng)法，該方法不僅耗時長，而且容易造成結果數據的誤差，從而影響試驗結果。近幾年，檢驗檢測機構致力于快速檢測技術和方法的研究，以提高食品中單增李斯特菌檢測的準確性和可靠性，其中的常規(guī)新方法有以下幾種。

1.1 顯色培養(yǎng)基技術

顯色培養(yǎng)基微生物快速檢驗技術是指借助于微生物所對應的種屬特異酶，在培養(yǎng)基中加入與之對應的顯色酶，在微生物生長代謝過程中產生酶，發(fā)揮對底物的水解效果，從而對培養(yǎng)物進行著色，實現對微生物的準確鑒定。法國研究人員于1974年首次開發(fā)顯色培養(yǎng)基，并將其應用于對大腸桿菌的檢驗中，后期應用范圍不斷擴展，價值日益凸顯。顯色培養(yǎng)基已被應用于對單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀菌等快速檢測過程中，檢測人員可以根據不同菌群在不同的顯色培養(yǎng)基的顯色效果，可快速檢測，判定該菌群種類。此外，根據著色的差異還有快速紙片法，在單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等微生物的檢測中具有快速、準確的優(yōu)勢。

1.2 電阻抗法

電阻抗法是近年來發(fā)展起來的一項生物學技術。電阻抗法的技術原理是細菌在瓊脂培養(yǎng)基內生長繁殖的過程中，導致培養(yǎng)基中大分子電惰性物質如碳水化合物、蛋白質等代謝為活性小分子物質，從而增強瓊脂培養(yǎng)基的導電性，改變培養(yǎng)基的電阻抗，通過檢測電阻抗來判定培養(yǎng)基中細菌的生長繁殖情況[1]，判定細菌在瓊脂培養(yǎng)基中的生長繁殖特性，即可檢測出相應的細菌。該方法已被用于單增李斯特菌、菌落總數、霉菌、酵母菌、大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌等病原微生物的檢測[2]。

1.3 免疫磁珠的分離方法檢測

陽性分離法磁珠結合的細胞即為所要分離獲得的細胞，而陰性分離法磁珠結合不需要獲得的細胞，游離于磁場的細胞為所需細胞，采用免疫磁珠的分離方式，將特異性抗體與磁珠顆粒的表面進行關聯(lián)，可將樣品中的微生物進行特異性結合，通過外部磁場的作用，裝有病毒的微生物磁珠會在其作用之下向兩端靠攏，可使微生物從樣品中分離出來。這種方法相對于普通檢測方法而言，可以在含有大量細菌的溶液中，選擇性地將微生物分離出來，具有較高的檢出效率[3]。一般來說，陰性磁珠分離法比陽性分離法用的磁珠多，因此選擇陽性磁珠分離的方法較多。但該方法會對細胞造成機械壓力，影響其生物學活性，不利于細菌分離后的培養(yǎng)，而且成本較高，操作較為繁瑣，不利于在實驗室進行微生物的快速檢測。

1.4 納米裝置

納米裝置就是根據納米粒子的特性，把納米粒子用于標記物檢測裝置。當物體的尺度小到納米尺度時，就會表現出與宏觀尺度物質不同的性能，因此稱為納米效應。納米效應可作為生物分析標記物質，能夠極大地改善標記物性能，顯著提升靈敏度[4]。雖然該方法檢測的試驗數據靈敏度高、特異性較強，但就目前檢測實驗室的整體情況而言，該方法在應用上還有較大難度。

2 微生物檢測的分子生物學技術

分子生物學技術是一種現代新型的分子技術，在食品微生物檢測過程中，主要是在分子水平上分析微生物的線性結構以認知樣本中的微生物類型，其主要優(yōu)點是特異性強、靈敏度高。Liu-Stratton等[5]證實分子生物學技術在食品檢測中應用廣泛，分子生物學檢測與基因的表達對食品檢測具有重要意義。

2.1 可視化基因芯片技術

基因芯片以其高靈敏度、高通量的特點逐漸成為致病微生物檢測研究的熱點，對于普通的基因芯片在雜交反應結束后還需使用熒光掃描顯微鏡對結果進行分析，給實驗室在使用上造成一定困難。為解決基因芯片試驗結果處理與分析的難題，開發(fā)一種新的芯片技術——可視化基因芯片技術。Ostroff等[6]證實酶在催化作用下產生沉淀，并沉積于基因芯片表面，使基因芯片的厚度發(fā)生明顯的變化，導致反射在基因芯片上光的波長發(fā)生實質改變，通過基因芯片上顏色的變化來觀察試驗結果?？梢暬蛐酒夹g檢測效率高，操作方便快捷，能夠在較短時間內得出檢測結果，雖然一次可視芯片技術檢測能夠檢測出多種潛在致病菌，但是由于可視化基因芯片檢測技術成本較高，操作要求比較繁瑣，因此，未在食品安全領域有較多推廣[7]。

2.2 熒光標記噬菌體技術

熒光標記噬菌體技術是根據噬菌體特異性侵染宿主菌的原理，選用合適的染色劑將噬菌體的核酸進行染色標記，用標記過的噬菌體侵染相應的宿主菌，噬菌體吸附在其宿主菌表面后，隨即將標記過的核酸注入宿主細胞，隨著越來越多的噬菌體核酸的注入，細胞內熒光隨著熒光素的增多而增強，借助熒光顯微鏡便能判定宿主菌的存在，從而實現病原菌的檢測[8]。Mosier-Boss等[9]在前人基礎上，將熒光染料YOYO-1更換為靈敏度較高，且對噬菌體結構和功能都無破壞性的SYBR gold核酸染料標記沙門菌噬菌體P22，成功檢測到沙門菌LT2株，同時與核酸染料作對比，結果顯示SYBR gold染劑是試驗效果最好的核酸染料；Phea等[10]與Flajshans等[11]分別將SYBR greenⅠ和SYBR green Ⅱ用于單增李斯特菌、大腸桿菌及沙門菌的檢測，均成功檢出，且靈敏度較高，特異性強，該方法完全可用于實際生產中微生物的檢測。多數噬菌體與宿主呈一一對應關系，雖特異性極高，但宿主范圍較窄，且噬菌體與宿主作用的裂解機理尚不明確，有待進一步研究，所以該技術在實踐中的應用相對較少。但是熒光標記噬菌體技術，檢測周期短，能區(qū)分死活細菌，準確性好，檢測前無需將細菌純化，預增菌后即可用于檢測，整個過程可在8 h內結束，且可以對多個細菌進行同步檢測，因此該項技術在食源性致病菌的檢測中有廣闊的發(fā)展前景。

2.3 熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）

熒光定量PCR技術是1996年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新的定量檢測技術，通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR的產物進行標記，使用熒光定量PCR儀對圖示結果進行分析，計算出待檢樣品的初始濃度[12]。Cheng等[13]利用設計的引物和探針檢測沙門菌的262 bp基因片段，Bialek等[14]熒光定量PCR-探針法分析藥物分子含量。熒光定量PCR技術根據已知細菌的遺傳信息，設計特定的引物探針擴增序列，根據是否有特定長度擴增產物的出現判斷是否存在檢測的目標細菌[15]。該方法用于微生物及病原菌毒素檢測具有快速、靈敏、特異性強等優(yōu)點[16]。此外熒光定量PCR技術可實現多通道、多項目的檢測，在食品中單增李斯特菌等致病菌檢測中發(fā)揮重要作用。

2.4 基因探針技術

生物技術用于食品檢測是十分常見的技術手段，尤其是一些富含大量微生物的食品，如在酸奶、乳酸菌飲料中含有大量對人體有益的菌類，如何正確區(qū)分有益菌和致病菌，只有依靠生物技術才能實現?；蛱结樇夹g在這一點上表現得十分出色，能準確地檢測出食品中的菌類[17]。基因探針技術是用一段已知基因的核酸序列作為探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時，若兩者的堿基完全配對，可互補結合成雙鏈，表明被測基因組DNA中含有已知的基因序列。該技術具有特殊性強、靈活性高、操縱便捷、省時等優(yōu)勢。但該技術也有局限性，主要體現在成本高等方面。

2.5 微滴數字PCR技術（micro drop digital polymerase chain reaction，ddPCR）

微滴數字PCR擴增前是將一個大的反應體系進行微滴化處理，利用油包水技術將其“分割”為數萬個納升級的微滴[18]，每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或含有至少一個待檢核酸靶分子，并且每個微滴都是一個獨立的PCR反應體系。根據陽性微滴的個數與比例，利用泊松分布原理得出靶分子的起始拷貝數，從而實現對最初反應體系中核酸靶分子數的絕對定量[19]。該方法在傳統(tǒng)的PCR擴增前將含有核酸分子的反應體系進行有效分割，通過PCR擴增和熒光信號的積累讀取陽性反應單元數，計算出檢測樣本的DNA分子數目[20]。由于ddPCR技術降低了對反應擴增效率的要求，可以有效勝任許多稀有變異的檢測工作。ddPCR技術采用一種全新的方式進行核酸分子的定量，與傳統(tǒng)的普通PCR和熒光定量PCR相比，其結果的精確度、準確性和靈敏度更佳。ddPCR技術比傳統(tǒng)的熒光定量PCR方法更加準確，特異性更強，靈敏度更高，能夠做到絕對定量。該技術在微生物檢測、轉基因檢測、地溝油檢測、動物疫病檢測、疾病檢測以及質檢領域的研究和應用中已凸顯優(yōu)勢，隨著微滴數字PCR儀的普及應用，該技術必將被廣泛應用于生命科學的各個領域。

2.6 疊氮溴化乙錠-聚合酶鏈式反應（ethidium monoazide bromide-polymerase chain reaction，EMA-PCR）檢測技術

將EMA與熒光定量PCR技術相結合，能夠有效、快速地檢測出食品中的食源性致病菌，而且EMA作為DNA結合染料，能夠快速滲透細胞壁，穿透細菌的細胞膜，從而進入細胞體內。通常死細胞的細胞膜已遭到破壞，EMA很容易滲透到細胞內部，插入到細胞內DNA雙螺旋上。但活菌的細胞膜比較完整，EMA不能滲透到活細胞內。選用一定濃度比例的EMA與菌液結合，經過高強度的鎢燈照射處理，插入到DNA雙螺旋上的EMA能夠與DNA雙螺旋發(fā)生共價交叉偶合，且這種共價偶合具有不可逆性，抑制后續(xù)PCR擴增中引物與死菌DNA的結合，從而達到區(qū)分死活菌的目的[21]。該方法的建立能夠快速、準確地區(qū)分、鑒定死菌和活菌，與普通PCR方法比較，大幅降低假陽性結果。該方法具有檢測結果準確、檢測周期短、靈敏度高等特點，在食品中單增李斯特菌等致病菌微生物檢測領域應用前景廣泛。

3 結語與展望

從分子學角度來看，單增李斯特菌檢測技術的發(fā)展從普通的培養(yǎng)基培養(yǎng)法，再到后來的PCR技術、熒光定量PCR方法和絕對定量PCR技術，實現微生物檢測從定性到絕對定量的質的發(fā)展。微滴式數字PCR技術是近年來發(fā)展起來的絕對定量技術，該方法是在PCR擴增前將含有核酸分子的反應體系進行有效分割，微滴式數字PCR技術的定量檢測限比傳統(tǒng)PCR技術低，特異性、重復性和傳統(tǒng)定量PCR也存在極大的優(yōu)勢。鑒于這種微滴反應能極大程度分散反應體系，可以有效消除抑制因子的作用，保證檢測過程中的擴增效率，對檢測低含量目標核酸分子的樣品有良好的效果[22]。因此，在微生物檢測與研究中，可將EMA與微滴式數字PCR技術相結合，用于活體微生物的檢測，運用其絕對定量檢測的優(yōu)點，應用在日常的微生物檢測過程，其與常規(guī)PCR檢測技術相比最大的不同就是當檢測相同樣品數量時，運用EMA與微滴式數字PCR技術檢測的時間短、靈敏度高，而且能夠做到絕對定量。

食品安全問題與人體生命健康緊密相關，分子生物學技術能夠快速、準確地檢驗食品微生物數量和種類，是評價食品是否合格的重要標志之一，對促進食品行業(yè)的快速發(fā)展、提升食品安全質量具有重要的現實意義。因此，應加大對食品微生物檢驗技術的投入，使食品質量更加安全可靠。運用簡便、快捷的分子生物學方法不僅可以在食品微生物檢測過程中提高檢出率，而且在人畜共患病的診斷等方面也有廣闊應用前景。