水產品中的微生物檢驗方法研究進展

張 雯

（大連海寶食品有限公司，遼寧大連 116041）

水產品中存在的微生物會威脅到消費者的身體健康，易引發消費者腹瀉、嘔吐等病癥，因此水產品微生物檢驗一直以來都是食品安全防護的重點內容。在水產品微生物檢驗過程中，主要是對水產品中大腸桿菌、致病菌及菌落總數進行研究。隨著科學技術的發展以及分子生物學技術的進步，近年來出現了許多新興的微生物檢驗方法，水產品檢驗質量、檢測效率得到了質的提升，微生物檢驗結果更準確[1]。

1 水產品中的微生物檢驗技術

1.1 水產品中的微生物儀器分析檢驗技術

儀器分析檢驗技術作為水產品微生物檢驗技術之一，主要分為近紅外光譜技術、氣相色譜法以及高效液相色譜法。其中，近紅外光譜技術能對水產品中的有機化合物和含有不同含氫基團的肉類成分含量進行有效測定和檢驗，進而得出食品微生物情況。近紅外技術的優勢主要體現在快速、準確、方便的食品品質分析、品種和產地來源鑒別、生產工藝鑒別和摻假鑒別等方面，我國近紅外光譜技術發展時間較短，目前主要應用于煙草、制藥等領域，在食品領域的應用相對較少。氣相色譜法和高效液相色譜法是通過對微生物化學組成以及微生物所產生的代謝產物進行水產品微生物檢驗[2]。與其他微生物檢驗技術相比，氣相色譜法和高效液相色譜法最明顯的檢驗優勢是靈敏性強、檢驗速度快、檢驗結果準確。在微生物檢驗過程中，這兩類技術獲取微生物成分的時間更短，需用到的檢驗樣本更少，這兩類技術的未來發展潛力和開發性較強。

1.2 水產品中的微生物代謝分析檢驗技術

微生物代謝分析檢驗技術也是水產品微生物檢驗常用的技術方法，其可以分為ATP生物發光檢驗法和電特性參數測量檢驗法。在水產品微生物檢驗中使用ATP生物發光檢驗方法主要是通過對水產品樣本的細菌ATP和體細胞ATP檢驗達到檢測水產品微生物情況的目的。ATP生物發光檢驗方法原理是在熒光素、ATP以及O2作為底物的時候，熒光素酶能在Mg2+存在的情況下，將化學能轉化為光能，以此反映檢驗樣本的微生物情況。從檢測原理上來說，電特性參數測量微生物檢驗技術是一項較為直觀的檢驗方法。由于在對水產品微生物進行檢驗的過程中，需對檢驗樣本的初始菌量進行推算，因此電特性參數測量檢驗方法會對電導時間以及微生物生長情況建立曲線關系，以此反應水產品微生物情況，獲得檢驗結果，直接呈現水產品微生物情況。無論是哪一種微生物檢驗方法，都有其獨特的優勢和檢驗條件，具體的檢驗方法選擇要以實際檢驗需求以及檢驗條件為主進行考慮，各種方法都有其最適宜的檢測對象、適用的范圍和場合，也各有其特點和不足之處。

1.3 水產品中的微生物傳統PCR及改進PCR檢驗技術

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）具有操作簡便、檢測速度快、靈敏度高和數據準確等優勢，在水產品微生物檢測中得到了廣泛應用。PCR技術可有效檢測出水產品中的副溶血性弧菌、腸出血性大腸桿菌等，運用PCR技術對水產品進行檢測，可有效避免具有安全隱患的食品流入市場，在保證水產品安全方面發揮著重要作用。

近幾年，在PCR技術的快速發展下，對原有PCR檢測技術不斷改進與創新，改進PCR檢驗技術包括多重PCR、微滴數字PCR技術等[3]。①多重PCR檢測法是傳統PCR技術的創新，傳統PCR技術在檢測中利用單引物，而多重PCR技術是運用多個DNA檢測引物檢測，由于在反應前添加多個DNA引物，與聚合酶反應后可獲得多個不同的DNA片段，可實現對微生物多個致病菌的檢測，在檢測效果與效率方面都得到了大幅度提高。②PR-PCR檢測法是傳統PCR技術的升級，該技術的主要原理是通過提取組織中的總RNA，再以mRNA為模板，利用逆轉錄酶反轉錄形成cDNA。③微滴式數字PCR技術是一種全新的定量核酸分子的方式，該技術通過PCR擴增和熒光信號的積累，再對陽性反應的單元數進行讀取，進而對樣本中的DNA分子數進行計算，在檢測結果的準確度、靈敏度方面效果更佳，并且能夠實現絕對定量，在水產品微生物檢測方面發展前景廣闊[4]。

1.4 水產品中的微生物基因芯片檢驗技術

基因芯片技術是將寡核苷酸放在芯片的表面，提取其DNA，通過PCR技術，將其與芯片上的寡核苷酸進行雜交，利用掃描系統對其進行定量分析，從而判斷水產品中是否有特定的微生物。基因芯片技術能全面、高效、快速地檢測微生物。基因芯片技術對樣品需求量少，檢驗自動化程度高，與傳統微生物檢測技術相比，基因芯片技術在確定病原體類型以及對抗體產生之前的感染情況進行檢驗方面體現出一定的優勢，同時還能有效確定感染程度及范圍[5]。基因芯片技術正在向著利用同一芯片同時檢測多種微生物的方向發展，能夠進一步提升檢測準確性和時效性。同時，在水產品的微生物檢測方面要不斷加強與完善，不斷優化檢測程序、降低檢測成本和建立標準化流程。

1.5 水產品中的微生物檢驗學技術

對微生物形態進行檢查是檢驗水產品中微生物的常用檢驗手段之一。由于微生物個體微小，單靠檢驗人員肉眼無法觀測到微生物的形態，因此在微生物形態檢查時，檢驗人員會借助顯微鏡放大檢驗樣本，仔細觀測記錄樣本微生物的形態結構和染色反應性，從而實現微生物檢驗目的。一般情況下，水產品微生物的形態結構借助普通光學顯微鏡就能仔細觀察到，但如果還想進一步觀察檢測樣本內部超微結構，就需借助電子顯微鏡進行觀察。

在水產品微生物檢驗中，常用的光學顯微鏡有普通光學顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。普通光學顯微鏡在檢測水產品樣本的微生物時，以自然光或燈光為光源，利用油（浸）鏡放大樣本，實現樣本直接觀察的目的。暗視野顯微鏡是在普通光學顯微鏡中安裝暗視野聚光器，使光源無法直接從顯微鏡中間透入，只能從暗視野聚光器的邊緣斜射到檢驗樣本上，檢驗樣本在接收到斜射光后會出現散射，樣本中的光亮微生物也能因此被觀察到。相差顯微鏡是借助相差板光珊作用改變直射光的光相位以及振幅，從而通過檢驗樣本的光強度差異觀察到樣本微生物的形態結構和運動方式。熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡的使用區別為熒光顯微鏡在微生物檢驗過程中主要選用高壓汞燈作為觀察光源，選用不同的濾光片進行配合實現微生物檢驗目的，多應用于同熒光抗體結合或利用熒光素進行染色的水產品微生物樣本檢測。電子顯微鏡是以電子流為微生物檢驗光源，借助磁線電圈放大檢驗樣本，從而達到觀察微生物結構的目的，原理是電子束通過加速電壓作用于樣品上，電子與物質相互作用產生透射電子，從而進行形貌觀察、成分分析等。

此外，在水產品微生物檢驗中，還可采用不染色標本檢驗方式和染色標本檢驗方式進行檢驗。水產品檢驗標本在未染色時，可通過標本的折光率以及檢驗標本環境差異觀察標本微生物情況，常用的不染色標本檢驗方式有懸滴法、壓滴法以及毛細管法，具體檢驗方式選擇以檢驗要求、檢驗樣本、檢驗條件為主。染色標本檢驗方式是通過對檢驗水產品標本的染色，使標本中的微生物與周邊環境在顏色上顯現出差異，通過顏色差異比對了解水產品檢驗樣本微生物情況，并可以直接清晰地觀察到微生物的形態結構。染色標本檢驗分為單染色法、復染色法、特殊染色法、負染色法和熒光染色法等，無論哪種染色方法都需要先進行涂片制備，再利用火焰進行固定，方便后續進行標本染色。當干燥的水產品微生物檢驗標本迅速在火焰中通過3次后，即可選擇合適的染色方法進行標本染色。復染色法需再進行一次脫色和復染過程，將水產品微生物檢驗標本染成不同的顏色，以此直接觀察標本微生物情況[6]。

1.6 水產品中的微生物培養法檢驗技術

微生物培養檢驗技術主要是通過對菌體理化特性的分析達到微生物檢驗目的，它是誕生于20世紀80年代的傳統微生物檢驗技術，隨著分子生物技術的發展，微生物培養檢驗技術也在不斷發展創新。微生物培養檢驗技術主要是通過對檢驗目標進行指標劑、熒光物質以及抑菌計量應用進行增菌時間檢驗和微生物培養鑒定，并對鑒定情況進行總結，確定檢驗對象的安全性。在微生物培養檢驗技術中，疏水網膜法以及葡萄糖苷酶熒光法都是常應用的檢驗技術，葡萄糖苷酶熒光法能快速檢驗水產品中的大腸桿菌細菌含量，疏水網膜法能對水產品中的霉菌以及沙門氏菌進行快速檢測。

2 結語

綜上所述，水產品中的微生物含量對產品整體安全質量有著直接的影響，做好水產品微生物檢驗工作能有效避免食源性疾病的發生，滿足消費者當下的食品健康要求。因此，相關部門必須重視食品安全檢驗活動的實施。目前，水產品微生物主要使用的檢驗技術為儀器分析技術、代謝技術、環境溫濕度檢驗控制、檢驗學檢驗技術以及微生物培養法檢驗技術。不同的檢驗技術有不同的優缺點，為保證微生物檢驗結果的準確性，在檢驗過程中最好結合實際檢驗需求、檢驗情況以及檢驗條件選擇合適的檢驗技術，從而保證產品微生物檢驗結果的科學性和準確性，提升我國水產品行業的安全性。