miR-410-3p通過介導HMGB1的表達調控NF-κB信號通路調控缺氧缺血性腦損傷

張顯英 仇 華 陳 青 （山東省滕州市中心人民醫院新生兒科，滕州 277599）

新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain injury，HIBD）是新生兒在圍產期窒息而出現的腦部缺氧缺血性損傷［1］。HIBD是導致新生兒急性死亡率升高的主要原因，發達國家每年每1 000名新生兒中約有5名受此影響［2］。此外，新生兒期HIBD相關死亡率高達40%，另有30%的患者可能患有神經后遺癥，如智力遲鈍和腦癱，這可能對兒童、其家庭和整個社會構成沉重負擔。新生兒HIBD的發病機制復雜，涉及多種不同因素，由自由基生產、離子不平衡、興奮毒性和炎癥反應引起的神經元凋亡和自噬在HIBD的發展中發揮重要作用，其發生機制尚不明確［3-6］。

由于神經炎癥反應引起的繼發性腦損傷在HIBD中起著重要作用，抑制炎癥反應可能保護缺氧缺血腦組織［7-9］。TLR4/核因子kappa-B（NF-κB）信號通路在激活中性淋巴瘤和腦缺血缺氧、一氧化碳腦缺血、腦外傷等引起的腦損傷機制中起著重要作用［10-13］。TLR4可與HMGB1結合，向上調節骨髓分化因子88（MyD88）的表達，然后激活NF-κB信號通路，最終誘發人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVECs）的炎癥反應，組織局部缺血和炎癥后HMGB1表達水平明顯提高，并且誘導了細胞凋亡［14］。microRNA（miRNA）是近年的研究熱點，可參與神經元細胞的正常生長發育［15-16］。已有研究表明，miR-410-3p通過靶向HMGB1抑制骨關節炎小鼠軟骨細胞凋亡和炎癥［17］。

但目前尚無研究報道miR-410-3p在缺氧缺血性腦損傷中的表達，以及miR-410-3p、HMGB1/NFκB在缺氧缺血性腦損傷中的調控機制。因此，本研究采用PC12細胞進行缺氧缺血處理，并通過相關轉染處理，以探究miR-410-3p通過介導HMGB1/NFκB通路對缺氧缺血性神經元細胞生物學特性的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與試劑 大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞PC12細胞購自通派（上海）生物科技有限公司；胰蛋白酶-EDTA（Gibco，25200072，美國）；Lipofectamin2000試劑盒（Invitrogen，美國）；Trizol（貨號：16096020，賽默飛世爾科技，美國）；TaqMan Micro RNA Assays ReverseTranscription Primer（Thermoscientific公司，美國）；SYBR?PremixExTaqTMⅡ試劑盒（行知生物科技有限公司，中國）；RIPA裂解液（R0010，Solarbio，中國）；BCA試劑盒（賽默飛公司，美國）；雙熒光素酶報告試劑盒（Promega）；PVDF膜（ISEQ00010，Millipore，美 國）；一 抗 兔 抗HMGB1（ab18256）、NF-κB p65（ab16502）、GAPDH（ab8245）（Abcam，英國）；HRP標記的羊抗兔IgG抗體（北京中山生物技術有限公司，中國）；ECL熒光檢測試劑盒（貨號BB-3501，Ameshame公司，英國）；IL-8、IL-6、TNF-α檢測試劑盒（69-21138、69-25328、69-40133，武漢默沙克，中國）；CCK-8（Sigma，美國）；Annexin V-FITC（ab14085，Abcam，美國）。

1.1.2 主要儀器 酶標儀（NYW-96M，北京諾亞威儀器儀表有限公司，中國）；Bio-Rad圖像分析系統（Bio-Rad公司，美國）；ABIPRISM?7300（型號：Prism?7300，上海坤科儀器設備有限公司，中國）；流式細胞儀（BD FACSCantoⅡ，北京安麥格貿易有限公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養PC12細胞系置于含5%胎牛血清、5%馬血清和10 U/L鏈霉素的DMEM培養箱中，在37℃、5%CO2環境下恒溫培養。

1.2.2 缺氧缺血細胞模型構建PC12細胞于含10%胎牛血清與二抗（50μg/ml青霉素、鏈霉素）的DMEM中培養，5%CO2、37℃的恒溫孵育箱中培養，待細胞密度長至85%～90%時進行傳代培養。然后，37℃下，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1 min，500 g離心5 min，將沉淀的細胞以1∶3的比例進行傳代。第3～6代的匯合細胞用于所有實驗。為了構建體外細胞缺氧缺血模型，將PC12細胞在95%N2、5%CO2和37℃環境下的無糖平衡鹽溶液中培養2 h。除去培養基并用PBS沖洗3次。

1.2.3 細胞轉染 將細胞分為6組：Normal組（正常PC12細胞）、NC組（缺血性處理的PC12細胞，轉染陰性對照質粒）、Model組（缺血性處理的PC12細胞）、miR-410-3p mimic組（缺血性處理的PC12細胞，轉染miR-410-3p過表達質粒）、HMGB1 vector組（缺血性處理的PC12細胞，轉染HMGB1過表達質粒）、miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組（缺血性處理的PC12細胞，共染miR-410-3p過表達和HMGB1過表達質粒）。

Normal組細胞不做缺氧缺血處理。其余組細胞均進行缺氧缺血處理。將細胞以3×105個/孔接種于6孔板中，細胞生長密度達到50%～60%時即可使用Lipofectamin2000試劑盒進行轉染。5μl目的質粒（miR-410-3p mimic或HMGB1 vector）稀釋至250μl Opti-MEM培養基中，另將6μl Lipofectamin2000稀釋至250μl Opti-MEM培養基中，輕彈混勻。室溫靜置5 min后將兩液體均勻混合，靜置20 min后滴入細胞培養孔中，輕晃培養板混勻之后置于37℃、5%CO2細胞培養箱中繼續培養，6 h后更換完全培養基，轉染后36 h收集細胞進行實驗。

1.2.4 熒光素酶報告系統 經過生物學預測網站（www.targetscan.org）進行miR-410-3p與HMGB1結合位點的分析。通過雙熒光素酶報告系統驗證miR-410-3p與HMGB1的靶向關系。構建靶基因HMGB1雙熒光素酶報告基因載體與miR-410-3p結合位點突變的突變體：PGL3-HMGB1wt和PGL3-HMGB1mut。將Rellina質粒和報告質粒分別與miR-410-3p mimcs和NC mimcs共轉染到HEK293T細胞中。在細胞轉染24 h后，進行雙熒光素酶檢測。首先將各組細胞裂解，裂解后以12 000 r/min離心1 min，去沉淀，收集上清液。按照雙熒光素酶報告試劑盒說明書測量熒光素酶活性。操作步驟如下：將裂解后的細胞樣品吸入EP管中，每10μl樣品中螢火蟲熒光素酶工作溶液100μl，測得螢火蟲熒光素酶之后加入海腎熒光素酶工作溶液100μl，測得海腎熒光素酶結果。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.2.5 qRT-PCR實驗Trizol試劑盒提取總RNA。TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer逆轉錄合成cDNA。SYBR?PremixExTaqTMⅡ試劑盒進行熒光定量PCR檢測。依次加入以下組分：25μl SYBR?PremixExTaqTMⅡ（2×），各2μl PCR正反向引物，ROXReferenceDye（50×）1μl，4μl DNA模板，16μl ddH2O。在ABIPRISM?7300系統進行熒光定量PCR，反應條件為：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，循環32次后72℃延伸1 min。ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（GAPDH），ΔΔCt=ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組），miR-19a以U6為內參，用2-ΔΔCt表示各目的基因相對表達量。引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

1.2.6 Western blot使用含PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度，去離子水調整濃度。樣品與加樣緩沖液混合，沸水浴10 min，在各泳道每孔加入30μg蛋白樣品，以80 V恒壓電泳2 h。將蛋白轉移至PVDF膜，電壓110 V，轉膜2 h。5%脫脂奶粉4℃封閉PVDF膜2 h。棄去封閉液，TBST洗1次，加入一抗兔抗HMGB1（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min。然后孵育HRP標記的羊抗兔IgG抗體（1∶5 000稀釋）。TBST漂洗后，置于干凈的玻璃平板上。取ECL熒光檢測試劑盒中等量的A液和B液，暗室中混勻，將其滴加膜上，放入凝膠成像儀中曝光成像。用Bio-Rad圖像分析系統照相，用Image J軟件分析，以相應蛋白條帶的灰度值/GAPDH蛋白條帶的灰度值表示相對蛋白含量。

1.2.7 ELISA參照ELISA檢測試劑盒說明書檢測細胞因子IL-8、IL-6、TNF-α的水平。

1.2.8 CCK-8檢測細胞增殖 各組細胞轉染48 h后，取對數生長期的細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養基制備成1×104個/ml的細胞懸液，接種至96孔培養板，根據實驗分組，每組各設8孔，每孔100μl，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，分別于培養48 h時取出培養板，每孔加入10μl CCK-8繼續培養1 h，在酶標儀450 nm處讀取各孔吸光度值（OD）值。實驗重復3次。

1.2.9 流式檢測凋亡 各組細胞接種于96孔板（2.0×103個/孔），PBS溶液洗滌2次后離心將細胞重懸于200μl結合緩沖液中，加入10μl Annexin VFITC和5μl PI輕輕混勻，避光室溫反應15 min，加入300μl結合緩沖液，用流式細胞儀以激發波長488 nm檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.3 統計學分析 所有數據均采用SPSS21.0統計學軟件進行處理，計量資料采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 雙熒光素酶報告檢測結果 通過生信網站分析發現miR-410-3p與HMGB1存在結合位點（圖1A）。雙熒光素酶報告檢測發現，miR-410-3p與突變的HMGB1的3'-UTR共轉染后無明顯差異，而miR-410-3p與野生型的HMGB1的3'-UTR共轉染后熒光素酶活性明顯降低（圖1B），結果表明，HMGB1是miR-410-3p的下游靶基因。

圖1 生信預測與雙熒光素酶報告檢測結果Fig.1 Results of biosynthesis prediction and dual luciferase report

2.2 各組PC12細胞中miR-410-3p表達情況qRT-PCR檢測各組細胞miR-410-3p表達情況，結果顯示，與Normal組對比，其余各組細胞miR-410-3p表達量均顯著降低（均P＜0.05）。與Model組對比，miR-410-3p mimic組miR-410-3p表達量顯著升高（P＜0.05）。與miR-410-3p mimic組相比，miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組miR-410-3p表達 量顯 著降低（P＜0.05）。Model組、NC組、HMGB1 vector組和miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組miR-410-3p表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 qRT-PCR檢測各組細胞中miR-410-3p表達情況Fig.2 qRT-PCR detection of miR-410-3p expression in each group of cells

2.3 各組PC12細胞中HMGB1 mRNA和蛋白表達情況qRT-PCR和Western blot檢測各組細胞中HMGB1 mRNA和蛋白表達情況，結果顯示，與Normal組對比，其余各組細胞HMGB1 mRNA和蛋白表達量均顯著升高（均P＜0.05）。與Model組對比，miR-410-3p mimic組HMGB1 mRNA和蛋白 水 平明顯降低，HMGB1 vector組HMGB1 mRNA和蛋白水平明顯升高（均P＜0.05）。與miR-410-3p mimic組相比，miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組HMGB1 mRNA和蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。Model組、NC組和miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組HMGB1 mRNA和蛋白水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 qRT-PCR和Western blot檢測各組細胞中HMGB1 mRNA和蛋白表達情況Fig.3 qRT-PCR and Western blot detection of HMGB1 mRNA and protein expression in each group of cells

2.4 各組PC12細胞增殖情況檢測結果CCK-8檢測各組細胞增殖情況，結果顯示，與Normal組對比，其余各組細胞OD值均顯著降低（均P＜0.05）。與Model組對比，miR-410-3p mimic組OD值顯著升高，HMGB1 vector組OD值顯著降低（均P＜0.05）。與miR-410-3p mimic組 相 比，miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組OD值顯著降低（P＜0.05）。Model組、NC組和miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組OD值差異無統計學意義（P＞0.05）。結果表明，過表達miR-410-3p會促進缺血性PC12細胞增殖，過表達HMGB1會抑制缺血性PC12細胞增殖，且過表達HMGB1可抵消miR-410-3p過表達對細胞增殖的促進作用。見圖4。

圖4 各組細胞OD值統計圖Fig.4 Statistics of OD values of cells in each group

2.5 各組PC12細胞凋亡情況檢測結果 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況，結果顯示，與Normal組對比，其余各組細胞凋亡比例均顯著升高（均P＜0.05）。與Model組對比，miR-410-3p mimic組凋亡比例顯著降低，HMGB1 vector組凋亡比例顯著升高（均P＜0.05）。與miR-410-3p mimic組相比，miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組 凋亡比例顯著升高（P＜0.05）。Model組、NC組 和miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組細胞凋亡比例差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況Fig.5 Flow cytometry to detect cell apoptosis in each group

2.6 各組PC12細胞炎癥因子檢測結果 檢測各組細胞氧化應激損傷相關指標檢測結果顯示，與Normal組相對比，其余各組PC12細胞中IL-8、IL-6、TNF-α水平均明顯較高（均P＜0.05）。與Model組對比，miR-410-3p mimic組IL-8、IL-6、TNF-α水平均明顯降低，HMGB1 vector組IL-8、IL-6、TNF-α水平均明顯較高（均P＜0.05）。與miR-410-3p mimic組相比，miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組IL-8、IL-6、TNFα水平均明顯升高（P＜0.05）。Model組、NC組和miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組細胞各指標含量差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見圖6。

圖6 各組PC12細胞炎癥因子檢測結果Fig.6 Test results of inflammatory factors in PC12 cells of each group

2.7 各組PC12細胞NF-κB p65蛋白表達檢測結果Western blot檢測各組PC12細胞中NF-κB p65蛋白表達情況，結果顯示，與Normal組相對比，其余各組PC12細胞中NF-κB p65的表達量均明顯升高（均P＜0.05）。與Model組對比，miR-410-3p mimic組NF-κB p65的表達量明顯降低，HMGB1 vector組NF-κB p65表達量明顯升高（均P＜0.05）。與miR-410-3p mimic組 相 比，miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組NF-κB p65的表達量明顯升高（P＜0.05）。NC組、Model組和miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組細胞NF-κB p65的表達量差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見圖7。

圖7 Western blot檢測各組細胞NF-κB p65蛋白表達水平Fig.7 Western blot detection of NF-κB p65 protein expression level in each group

3 討論

HIBD是一種可誘發炎癥性腦損傷的疾病，這也是嬰兒和兒童死亡和長期神經損傷的主要原因之一。HIBD引起的缺氧性腦病是兒童嚴重的腦部疾病，但尚無有效治療措施。經證實，HIBD的病理機制與氧化應激、炎癥和神經細胞凋亡等因素有關［18-24］。然而現有研究對于腦缺血的分子調控機制沒有較好的解釋，因此探究腦缺血的具體分子機制對腦缺血患者有效治療具有積極臨床意義。

目前已有研究表明，NF-κB信號通路的激活會促進IL-6、TNF-α和其他促炎細胞因子的表達，進而影響機體炎癥反應［25-26］。由于嚴重的炎癥反應可導致嚴重的組織損傷。在腦缺血的大鼠模型中，HMGB1與NF-κB p65的表達量均明顯增加，且HMGB1表達與NF-κB p65通路激活對腦脊髓炎有調控作用［27］。本研究中，HMGB1過表達會抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，同時造成NF-κB p65蛋白表達上調，同時炎癥因子IL-8、IL-6、TNF-α水平均明顯較高，本實驗結果與之前的文獻報道一致［25-27］。

通過文獻了解到miR-410-3p可通過調控下游靶基因影響多項生命活動。同時，miR-410-3p參與了炎癥、血管生成和腫瘤發生等多個過程［28-30］，其影響與HMGB1/NF-κB通路對腦缺血的調控相似，并且有文獻表明HMGB1是miR-410-3p的下游靶基因，并可通過介導NF-κB通路，從而調控腦缺血性神經細胞的增殖、凋亡和炎癥損傷［17］。首先，本課題組通過生信網站查到了miR-410-3p與HMGB1之間存在結合位點，為了進一步確認miR-410-3p與HMGB1之間的靶向關系，通過雙熒光素酶報告實驗進行驗證，確認miR-410-3p可負向調控HMGB1的表達。然后通過在缺血性PC12細胞中轉染miR-410-3p mimic序 列、HMGB1 vector載體和共轉染miR-410-3p mimic與HMGB1 vector載體。檢測各組細胞增殖、凋亡和炎癥因子水平。結果表明，過表達miR-410-3p可促進缺血性神經元增殖，抑制其細胞凋亡，并降低炎癥因子IL-8、IL-6、TNF-α水平。且同時轉染miR-410-3p mimic與HMGB1 vector載體會抵消過表達miR-410-3p對缺血性神經元細胞的影響。

本研究再次驗證了miR-410-3p與HMGB1的靶向關系，并證實在缺血性神經元細胞中miR-410-3p可通過負向調控HMGB1的表達，從而抑制NF-κB p65通路的活化，從而調控缺血性神經元細胞的增殖、凋亡和炎癥損傷。然而到目前為止，尚未能明確HMGB1/NF-κB通路對調控缺血性神經元細胞的增殖、凋亡和損傷的具體分子網絡，還需進一步設計實驗進行深入研究。