異鉤藤堿對(duì)癲癇大鼠SIRT1/p53/caspase-3通路及海馬神經(jīng)元凋亡的影響

雷 琦 朱婷鴿 何進(jìn)偉 趙 琳（陜西師范大學(xué)學(xué)府醫(yī)院內(nèi)科，西安 710119）

癲癇是一種致人衰弱的常見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，大腦中異常的電活動(dòng)可導(dǎo)致自發(fā)性癲癇反復(fù)發(fā)作［1］。癲癇發(fā)作有各種病因，從遺傳和先天性到神經(jīng)元異常，這些異常可由缺氧、感染和炎癥引起［2］。神經(jīng)元凋亡在癲癇的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮極其重要的作用，藥物干預(yù)可能成為治療癲癇的一條新途徑［3］。異鉤藤堿（isorhynchophylline，IRN）為鉤藤屬植物的主要生物堿成分，用于治療心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病［4］。SIRT1在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮內(nèi)源性凋亡抑制因子作用。p53可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡，SIRT1可通過(guò)催化p53去乙酰化調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。在癲癇發(fā)生過(guò)程中通過(guò)上調(diào)SIRT1表達(dá)可降低p53乙酰化水平，減輕癲癇發(fā)作［5］。然而，關(guān)于IRN是否可通過(guò)調(diào)控SIRT1/p53/caspase-3信號(hào)通路抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕癲癇的發(fā)作尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)制備癲癇大鼠模型，探究SIRT1/p53/caspase-3信號(hào)通路發(fā)揮的作用，為癲癇的預(yù)防及治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌雄SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)，許可證號(hào)：SCXK（粵）2016-0041。實(shí)驗(yàn)遵循“3R”原則。

1.1.2 主要試劑與儀器IRN（純度≥98%，S18310）、苯妥英鈉（純度≥98%，SD9350）購(gòu)自北京索萊寶公司；IL-6 ELISA試劑盒（ab178013）、IL-1β ELISA試 劑 盒（ab197742）、TNF-αELISA試 劑 盒（ab181421）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；SIRT1一抗（8469）、Acetyl-p53一抗（2525）、cleaved caspase-3一抗（9661）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像儀購(gòu)自杭州Miulab公司；水迷宮分析系統(tǒng)購(gòu)自上海欣軟信息科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 癲癇大鼠模型制備 采用氯化鋰-毛果蕓香堿經(jīng)典方法制備癲癇大鼠模型［5］。每只大鼠在注射毛果蕓香堿前18～20 h腹腔注射125 mg/kg的氯化鋰。毛果蕓香堿注射（25 mg/kg，腹腔注射）前30 min給予東莨菪堿預(yù)處理（1 mg/kg，腹腔注射）。大鼠癲癇發(fā)作根據(jù)Racine分級(jí)［6］，分級(jí)達(dá)到4級(jí)以上表明癲癇大鼠模型建立成功。注射毛果蕓香堿90 min后，給予10%水合氯醛（3 ml/kg）終止癲癇發(fā)作。對(duì)照組大鼠注射等量生理鹽水代替毛果蕓香堿。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理 將制備成功的60只癲癇大鼠隨機(jī)分為模型組、IRN低、中、高劑量組和苯妥英鈉組，每組12只。另取12只大鼠為對(duì)照組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劑量換算，IRN低、中、高劑量組大鼠分別按照15、30、60 mg/kg劑量腹腔注射。苯妥英鈉組按照30 mg/kg劑量腹腔注射［7］。1次/d，連續(xù)21 d。模型組和對(duì)照組腹腔注射生理鹽水作為對(duì)照。

1.2.3 大鼠癲癇發(fā)作情況檢測(cè) 末次給藥24 h后觀察大鼠癲癇發(fā)作情況，記錄大鼠1 d的發(fā)作次數(shù)和持續(xù)時(shí)間，并進(jìn)行Racine分級(jí)評(píng)分。

1.2.4 大鼠腦電圖檢測(cè) 利用生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄各組大鼠腦電波形，分析各組大鼠腦電波的頻率和波幅。

1.2.5 大鼠認(rèn)知能力的檢測(cè)［8］利用Morris水迷宮系統(tǒng)檢測(cè)各組大鼠的認(rèn)知能力，記錄大鼠逃避潛伏期及1 min內(nèi)穿越平臺(tái)原位置的次數(shù)。

1.2.6 樣本采集 麻醉大鼠，尾靜脈取血，血清置于-80℃冰箱保存。斷頭取腦，在4℃下分離雙側(cè)海馬組織，一側(cè)海馬組織置于4%多聚甲醛中固定，另一側(cè)海馬組織液氮速凍保存。

1.2.7 血清炎癥因子含量的檢測(cè) 采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.8 HE染色檢測(cè)海馬組織的病理變化 取出固定的海馬組織，脫水透明，浸蠟包埋，切片，采用HE試劑盒染色，光學(xué)顯微鏡觀察，分析各組大鼠海馬組織的病理變化。

1.2.9 TUNEL法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率 利用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別隨機(jī)選取5張切片，每張切片選擇5個(gè)具有代表性的高倍視野（×400）。細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.1 0大鼠海馬組織中SIRT1、p53、caspase-3相關(guān)蛋白表達(dá)水平測(cè)定 取出凍存的海馬組織，研磨加入蛋白裂解液制成勻漿，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入SIRT1、p53、Acetyl-p53、caspase-3、cleaved caspase-3一抗，4℃過(guò)夜，清洗后加二抗，37℃孵育40 min。曝光顯色，以β-actin為內(nèi)參蛋白，使用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IRN對(duì)癲癇大鼠癲癇發(fā)作情況的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時(shí)間及Racine評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，IRN各劑量組和苯妥英鈉組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時(shí)間及Racine評(píng)分降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠癲癇發(fā)作情況Fig.1 Epileptic seizures of rats in each group

2.2 IRN對(duì)癲癇大鼠腦電圖的影響 與對(duì)照組相比，模型組癲癇大鼠腦電頻率降低（P＜0.05），波幅明顯升高（P＜0.05）；經(jīng)IRN和苯妥英鈉處理后，明顯逆轉(zhuǎn)癲癇大鼠的腦電圖變化（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腦電圖分析Fig.2 Electroencephalogram analysis of rats in each group

2.3 IRN對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知能力的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），穿越平臺(tái)原位置次數(shù)明顯減少（P＜0.05）；經(jīng)IRN和苯妥英鈉處理后，明顯改善癲癇大鼠的認(rèn)知能力（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠認(rèn)知能力比較Fig.3 Comparison of cognitive ability of rats in each group

2.4 IRN對(duì)癲癇大鼠血清中炎癥因子含量的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著增多（P＜0.05）；經(jīng)IRN和苯妥英鈉處理后，明顯下調(diào)癲癇大鼠的炎癥因子水平（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠炎癥因子水平比較（pg/ml）Fig.4 Comparison of levels of inflammatory factors of rats in each group（pg/ml）

2.5 IRN對(duì)癲癇大鼠海馬組織病理變化的影響對(duì)照組大鼠海馬組織細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞膜完整，核仁清晰，染色質(zhì)分布均勻；模型組大鼠海馬組織細(xì)胞排列紊亂稀松，體積腫大，邊緣模糊，大量神經(jīng)元變性壞死，胞核固縮溶解；IRN各劑量組和苯妥英鈉組大鼠海馬組織細(xì)胞損傷程度減輕，排列較為松散，神經(jīng)元變性不明顯。見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠海馬組織HE染色結(jié)果圖（×200）Fig.5 HE staining results of hippocampus of each group of rats（×200）

2.6 IRN對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率升高（P＜0.05）；經(jīng)IRN和苯妥英鈉處理后，明顯減少了癲癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡（P＜0.05）。見(jiàn)圖6。

圖6 各組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率比較Fig.6 Comparison of apoptosis rate of hippocampus of rats in each group

圖8 各組大鼠海馬組織中蛋白表達(dá)水平比較Fig.8 Comparison of protein expression levels in hippocampus of rats in each group

2.7 IRN對(duì)癲癇大鼠海馬組織中SIRT1、p53、caspase-3相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬組織中Acetyl-p53/p53、cleaved caspase-3/caspase-3蛋白表達(dá)量增多（P＜0.05），SIRT1蛋白表達(dá)量減少（P＜0.05）；經(jīng)IRN和苯妥英鈉處理后，明顯逆轉(zhuǎn)癲癇大鼠蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）。見(jiàn)圖7、8。

圖7 各組大鼠海馬組織Western blot檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Western blot results of rat hippocampus in each group

3 討論

癲癇是一種神經(jīng)科常見(jiàn)病，與腦內(nèi)神經(jīng)元放電的異常同步性有關(guān)［9］。全世界有多達(dá)5 000萬(wàn)人受到影響，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，然而其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確［10］。鋰廣泛應(yīng)用于精神病學(xué)，其潛在用途包括治療躁狂癥和老年癡呆癥等。據(jù)報(bào)道，鋰對(duì)人類(lèi)的不良影響包括降低癲癇閾值和顳葉癲癇的沉淀［11］。因此，本研究采用氯化鋰-毛果蕓香堿經(jīng)典方法制備癲癇大鼠模型，結(jié)果顯示，造模大鼠海馬組織細(xì)胞排列紊亂稀松，大量神經(jīng)元變性壞死，細(xì)胞凋亡率升高，表明造模大鼠海馬組織出現(xiàn)明顯損傷。且造模后大鼠腦電波頻率降低，波幅升高，認(rèn)知能力減弱，提示模型構(gòu)建成功。

IRN有獨(dú)特的抗阿爾茨海默病活性。LI等［12］研究發(fā)現(xiàn)，IRN可減輕氯化鋁誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)和記憶障礙。本研究中在IRN的藥效作用下，癲癇大鼠海馬組織細(xì)胞損傷程度減輕，癲癇發(fā)作次數(shù)減少，持續(xù)時(shí)間明顯縮短，腦電頻率升高，波幅降低，認(rèn)知和學(xué)習(xí)能力增強(qiáng)，提示IRN可改善癲癇大鼠的海馬組織結(jié)構(gòu)損傷和認(rèn)知能力，減少癲癇發(fā)作。在評(píng)估IRN對(duì)小鼠認(rèn)知缺陷和淀粉樣蛋白病理的預(yù)防作用中發(fā)現(xiàn)，IRN可顯著降低IL-6、IL-1β、TNF-α水平，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)［13］。本研究中，IRN處理后，大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著下調(diào)，結(jié)果與其一致，表明IRN可下調(diào)癲癇大鼠炎癥因子水平。

研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1/p53/caspase-3信號(hào)通路與大腦神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)。腦缺血/再灌注大鼠模型中SIRT1過(guò)表達(dá)可減少梗死面積，降低p53蛋白乙酰化水平及caspase-3活性，減少細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。在研究miR-128在癲癇中的功能和分子作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗miR-128可能通過(guò)SIRT1/p53/Bax/細(xì)胞色素C/caspase信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［14］。本研究中，Acetyl-p53、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)升高，SIRT1蛋白表達(dá)降低，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高，提示SIRT1/p53/caspase-3信號(hào)通路可影響神經(jīng)細(xì)胞凋亡。而IRN處理后，明顯逆轉(zhuǎn)了癲癇大鼠海馬組織中的蛋白表達(dá)，表明IRN可能通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1/p53/caspase-3信號(hào)通路減輕細(xì)胞凋亡，緩解癲癇癥狀。

綜上所述，IRN可通過(guò)SIRT1/p53/caspase-3信號(hào)通路減少海馬組織神經(jīng)元凋亡，抑制大鼠癲癇發(fā)作。然而，癲癇的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，IRN對(duì)于癲癇的治療作用仍有待于進(jìn)一步研究。