千金子二萜醇調控TGF-β1/Smad通路影響腎癌小鼠TNF-α和IL-17表達①

蔣俊玲 趙俊峰 張嘉琪 周 磊 潘世杰 雷 震（河南中醫藥大學第二臨床醫學院，鄭州 450002）

腎癌是一種源于腎小管上皮的惡性腫瘤，2020年數據顯示，全球腎癌的新發病例占所有癌癥的4.1%，約2.4%患者死于腎癌［1］。腎癌治療以外科手術為主，綜合性治療為輔，一旦術后復發轉移，免疫治療的治愈率僅為20%左右［2-4］。因此，尋找延長腎癌患者有效生存率的新藥迫在眉睫。中藥千金子（Euphorbiae semen）記載于多種醫書，是續隨子（Euphorbia lathyrismL，屬大戟科植物）成熟后干燥的種子，別名小巴豆和蒲薩豆，具有多種抗腫瘤和抗腫瘤多重耐藥的活性成分。大戟提取物可抑制多種腫瘤（肺癌和肝癌）細胞體外增殖和轉移。本課題組前期研究發現，千金子二萜醇可抑制腎癌Renca細胞增殖（調控Bax、Bcl-2、Caspase-3及G0/G1期進程）、轉移和侵襲，體內實驗證實其可減緩腫瘤進展、調控NF-κB活性抑制MMPs表達。

作為一種較為普遍的促炎細胞因子，近年多數腫瘤和炎癥中可檢測到TGF-β1含量升高，可促進癌細胞增殖和轉移［5］。TGF-β1/Smad可調控晚期癌癥進展［6］。研究表明，TGF-β1可調控Smad2/3蛋白影響Foxp3（叉頭狀轉錄因子）和RORγt（維甲酸受體相關孤兒受體）表達，從而調控Th17細胞影響其下游細胞因子TNF-α和IL-17表達［7］。高表達的IL-17和TNF-α等細胞因子可促進腫瘤進展和分期［8-9］；TNF-α可增加DNA損傷和突變、異常細胞增殖和新生血管形成、MMPs產生、血管通透性和滲漏性促進癌癥進展；IL-17可促進MMPs釋放，通過誘導膠原和蛋白多糖蛋白水解變性，促進免疫細胞向炎癥部位遷移，誘導VEGF釋放，促進癌細胞遷移和組織入侵。研究發現，TGF-β1、IL-17和TNF-α等因子表達降低可抑制腎癌侵襲和轉移［10-12］。目前，國內外關于千金子能否調控TGF-β1/Smad通路活性從而影響腎癌中TNF-α和IL-17表達尚未見報道。

因此，本研究通過構建Renca腎癌小鼠模型，探討大戟提取物能否通過調節TGF-β1/Smad通路活化影響TNF-α和IL-17表達，進一步闡釋千金子的抗癌機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 千金子二萜醇（四川維克奇生物科技有限公司）；RPMI1640、FBS、0.25%胰酶-EDTA和Phosphate Buffered Saline（以色列BI公司）；青-鏈霉素混合液、二甲基亞砜、普通組織RIPA裂解液和ECL顯影液（索萊寶公司）；PEG-300和SB-431542（Med Chem Express公司）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；p-Smad2/p-Smad 3 Rabbit mAb（CST公 司）；Smad2/3 Rabbit pAb（ABclonal公司）；內參蛋白GAPDH Rabbit Polyclonal antibody（武漢三鷹有限公司）；TNF-α和IL-17A ELISA試劑盒（聯科生物）。

1.1.2 細胞及實驗動物Renca細胞（北納創聯生物技術有限公司）；4～8周齡雄性SPF級BALB/c小鼠（北京斯貝福生物技術有限公司），許可證號：SCXK（京）2019-0010，體質量18～22 g，于25℃、12 h光照/12 h黑暗實驗動物中心常規飼養，正常飲食飲水。動物實驗經河南省中醫院（河南中醫藥大學第二附屬醫院）倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 Renca細胞培養 將完全培養基中的Renca細胞恒溫培養至85%飽和，胰蛋白酶消化，離心，制備1×107個/ml細胞懸液，Countstar計數。

1.2.2 小鼠腎癌模型構建及分組給藥 小鼠腋窩（右前肢）皮下注射細胞懸液（0.2 ml/只），隨機分為模型組、實驗組和SB-431542組，10只/組，密切觀察腫瘤生長情況，長至5 mm約14 d，各組間瘤塊生長無明顯差異時開始給予藥物干預。實驗組（千金子二萜醇組）灌胃給予20 mg/kg千金子二萜醇溶液；模型組灌胃給予等量生理鹽水；SB-431542組（TGF-β1/Smad通路抑制劑組）給藥17 d開始連續腹腔注射10 mg/kg SB-431542溶液3 d，共給藥19 d，每3 d測量小鼠體質量及瘤塊長、短徑。給藥結束后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉小鼠，眼科彎頭鑷摘除小鼠眼球后取血，置于2 ml EP管離心，取上清，低溫保存，小心剝離小鼠皮下移植瘤瘤塊于液氮中冷凍，分離各組小鼠完整脾臟并稱重。

1.2.3 脾臟指數計算 計算各組腎癌移植瘤小鼠脾臟指數，脾臟指數（%）=脾臟重量（mg）/小鼠體質量（g）×100%，并進行分析。

1.2.4 Western blot檢測瘤塊TGF-β1/Smad通路表達 取米粒大小的瘤塊放入蛋白裂解液中提取蛋白，BCA法定量蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，轉至NC膜，5%脫脂奶粉封閉，加入Smad2/3和p-Smad2/3及GAPDH一抗4℃搖床孵育過夜，清洗后加入山羊抗兔抗體孵育1 h，ECL顯色，定量分析條帶灰度值。

1.2.5 ELISA檢測TNF-α和IL-17水平 將ELISA試劑盒及實驗物品平衡至室溫，按說明書操作，提前配備所需試劑，樣本孔里預先加入檢測緩沖液（×10倍稀釋為×1倍）80μl，加入20μl血清（室溫）振蕩混勻，測定小鼠血清450 nm、570 nm處OD值，按照實驗最終得到的標準曲線及OD值進行計算。

1.3 統計學分析 采用SPSS21.0軟件分析數據，計量數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 千金子二萜醇對腎癌移植瘤小鼠脾臟指數的影響 如圖1所示，給藥19 d后，實驗組和SB-431542組小鼠脾臟指數明顯低于模型組（4.71±1.11，4.45±0.34vs6.29±2.40），差異有統計學意義（F=3.626，P＜0.05）。

圖1 各組腎癌移植瘤小鼠脾臟指數Fig.1 SI of RCC transplanted mice in each group

2.2 千金子二萜醇對腎癌Renca移植瘤小鼠TGF-β1/Smad信號通路蛋白表達的影響 給藥19 d后，實驗組與SB-431542組小鼠Smad2/3蛋白表達明顯高于模型組（2.57±0.24，2.73±0.57vs1.56±0.29，F=7.858，P＜0.05），實 驗 組 與SB-431542組 小 鼠p-Smad2/3蛋白表達明顯低于模型組（0.32±0.08，0.22±0.09vs0.71±0.04，F=37.61，P＜0.01，圖2）。

圖2 Western blot檢測小鼠瘤塊中TGF-β1/Smad通路激活情況Fig.2 Activation of TGF-β1/Smad pathway in mouse tumor mass detected by Western blot

2.3 千金子二萜醇對腎癌小鼠血清TNF-α和IL-17表達的影響 給藥19 d后，與模型組相比，實驗組和SB-431542組小鼠血清TNF-α和IL-17含量降低（P＜0.01），但后兩組間差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 各組腎癌移植瘤小鼠血清TNF-α和IL-17表達（±s，n=8，pg/ml）Tab.1 Expressions of TNF-αand IL-17 in serum of RCC transplanted mice in each group（±s，n=8，pg/ml）

表1 各組腎癌移植瘤小鼠血清TNF-α和IL-17表達（±s，n=8，pg/ml）Tab.1 Expressions of TNF-αand IL-17 in serum of RCC transplanted mice in each group（±s，n=8，pg/ml）

Note：1）P＜0.01 vs model group.

Groups Model Experimental SB-431542 F P TNF-α 31.23±1.56 22.95±0.601）21.82±1.35 137.15＜0.01 IL-17 8.52±1.16 5.87±0.721）5.19±0.67 32.20＜0.01

3 討論

千金子作為我國傳統大戟屬中草藥，性溫味辛，毒性較小，調理大腸、肝和腎，主祛水消腫和破血消癥，在痰飲、積滯脹滿、水腫和大小便不暢等疾病治療中發揮作用。多位學者研究其化學成分及藥理作用發現，千金子中的二萜類、甾醇及香豆素等成分具有一定抗腫瘤、致瀉、抗炎鎮痛和美白等作用，其中二萜類化合物起主要作用。陶麗等［13］發現，千金子二萜醇及其衍生物對NSCLC有一定抗癌療效，在其母體醇環中引入酯類可增強抗腫瘤活性。ZHANG等［14］研究發現，千金子二萜類化合物能夠逆轉MCF-7細胞系中ABCB1（一種編碼p-糖蛋白的基因）介導的多重耐藥。近年本課題組通過研究千金子二萜醇對Renca細胞的作用機制發現，千金子二萜醇能夠抑制Renca細胞增殖過程中從G0期過渡到G1期、增加Bax和Caspase-3兩個促凋亡蛋白表達從而加速腫瘤細胞凋亡，同時降低Bcl-2表達加速細胞凋亡，并在一定程度抑制其侵襲和轉移，深入研究發現，腎癌小鼠模型中NF-κB激活也可被抑制［15］。本研究進一步驗證了千金子二萜醇對腎癌小鼠TGF-β1/Smad通路的影響及抗腫瘤機制。

近年腎癌被認為是一種免疫原性腫瘤，從最初IL-6和IL-8等細胞因子的非特異性免疫治療到針對VEGF的靶向治療，又轉向新的免疫治療［3，16-19］。研究表明，調節性T細胞等免疫抑制細胞產生的細胞因子能夠調控腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME），可一定程度介導免疫功能無法精準調節的紊亂。TME由腫瘤血管系統、淋巴細胞及炎癥微環境等組成，腫瘤進展與其中的IL-17和TNF-α等因子相關。研究發現，NF-κB通路可被TNF-α和IL-17等因子影響進而調控腫瘤中PD-L1及MMP-2/9蛋白表達，并影響腫瘤侵襲和轉移［15，20］。TNF-α是一種可促炎的多能細胞因子。IL-17A（多數指IL-17）是Th17細胞的標志性細胞因子，與IL-17F以同型二聚體或異型二聚體形式分泌，IL-17可與其二聚體受體（異源性）IL-17RA和IL-17RC結合，進一步激活Act1，而后TRAF6蛋白發生激活從而調控MAPK和NF-κB等通路加速腫瘤進展。TGF-β1可促進Th17細胞增殖分化，加強TNF-α和IL-17表達，且這兩種細胞因子在腎癌中呈高表達，與腎癌進展和分級有關。TGF-β1與其Ⅲ型受體（TβRⅢ）和TβRⅡ結合，進而募集TβRⅠ二聚體形成四聚體復合物（異源性），受體構象發生改變，導致TβRⅡ發生自身磷酸化，激活TβRⅠ，活化的TβRⅠ可促使Smad2/3蛋白向其磷酸化形式轉變，即p-Smad2/3，經過其他因子的輔助作用，Smad4與p-Smad2/3結合形成異源性復合物，在一系列因子作用下到達細胞核，上調Foxp3和RORγt表達而增強Th17細胞增殖分化，分泌IL-17和TNF-α［21-24］。

綜上，本研究發現腎癌小鼠TGF-β1/Smad通路激活受千金子二萜醇調控，進而降低血清TNF-α和IL-17含量，脾臟指數亦有所降低。由于缺乏具體基因層面分析及受免疫細胞檢測手段所限，本研究僅初步探討了千金子二萜醇對腎癌的抑制機制，仍需進一步完善相關作用機制和具體靶點，為中醫藥治療腎癌提供新的思路。