CTP介導的EGFRvⅢ肽疫苗誘導特異性免疫應答抑制腦膠質瘤的研究①

許瓊冠 歐陽一彬 謝鎮明（海南醫學院第二附屬醫院神經外科二區，海口 571103）

膠質瘤是腦內最常見原發性腫瘤，占中樞神經系統惡性腫瘤的81%［1-2］。根據世界衛生組織分類，膠質瘤分為4級，其中1級和2級為低級別膠質瘤，3級和4級為高級別膠質瘤，通常分級越高，預后越差。低級別膠質瘤的十年生存率為47%，中位生存期為11.6年。對于高級別膠質瘤，3級膠質瘤患者中位總生存期（overall survival，OS）約為3年，而4級膠質瘤患者中位OS時間僅為15個月［3-5］。盡管過去幾十年已開發了多種癌癥療法，但很少有藥物被批準用于膠質瘤治療。

EGFRvⅢ（EGFR variantⅢ）是過表達的EGFR基因最常見選擇性剪接形式之一，在膠質母細胞瘤中表達率為15%～40%［6-7］。EGFRvⅢ突變是從外顯子2到7的選擇性剪接，導致胞外區6～273個氨基酸殘基缺失，并在融合連接處插入了1個新的甘氨酸，形成1個新的表位［8］。KLH與EGFRvⅢ新抗原的偶聯物命名為Rindopepimut（CDX-110），已進入Ⅲ期臨床試驗，作為晚期多形性膠質母細胞瘤的治療性疫苗［9］。因此，直接基于新抗原表位的多肽疫苗是治療膠質瘤的一種有吸引力的方案。但有研究報道，單肽免疫可能導致免疫耐受，而非激活抗腫瘤免疫應答［10］。為克服多肽疫苗免疫耐受，增強其免疫原性，在臨床前和臨床試驗中已對多種新抗原負載工具（如脂質體和納米載體）進行了評估［11-12］。但這些嘗試均基于內吞依賴途徑，限制了抗原提呈細胞對新抗原的交叉呈遞作用［13］。胞漿轉導肽（cytosolic transduction peptide，CTP）是一種11肽，可直接定位于胞漿［14］。研究表明，CTP-β-GAL融合蛋白在脾臟和淋巴結等免疫器官中有較高聚集趨勢，特異性分布于脾臟濾泡和邊緣區，提示CTP融合蛋白可能對包括抗原提呈細胞在內的血細胞具有較高親和性［15］。本研究擬探索CTP修飾的EGFRvⅢ多肽疫苗是否可激活體內抗腫瘤免疫應答，從而抑制膠質瘤生長。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源16例腦膠質瘤患者癌旁組織及35例腫瘤組織取自海南醫學院第二附屬醫院，所有組織獲取經海南醫學院第二附屬醫院倫理委員會批準，患者知情同意?；颊呱鏀祿珊Ｄ厢t學院第二附屬醫院對患者進行跟蹤隨訪獲得。

1.1.2 主要試劑GL261-Luc細胞系購自北京科瑞思搏生物科技有限公司；脾淋巴細胞分離試劑盒購自TBD公司；CD8+T淋巴細胞分離試劑盒購自德國Miltenyi公司；GM-CSF、IL-4、IL-2購自美國R&D Systems；β-巰基乙醇購自美國Sigma公司；TRIzol試劑購自生工生物工程有限公司；SYBR1 Green PCR kits購自日本TaKaRa公司；TUNEL凋亡試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司；抗CD8抗體購自美國eBioscience公司；抗CD-69流式抗體購自美國Biolegend公司；抗CD3免疫組化抗體購自美國Abcam公司；CFSE染色試劑購自美國Thermo Fisher公司。

1.1.3 實驗動物8周齡雌性BALB/c小鼠購自海南醫學院實驗動物中心，動物合格證號：20200501 BZX300108。所有動物實驗經海南醫學院第二附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養GL261-Luc細胞系采用含10%FBS的DMEM培養基于37℃、5%CO2培養；6～8周齡雄性BALB/c小鼠骨髓細胞加入GM-CSF（10 ng/ml）和IL-4（5 ng/ml）使其培養分化為樹突狀細胞（dendritic cells，DCs），脾淋巴細胞分離試劑盒分離淋巴細胞，按照說明書采用CD8+T淋巴細胞分離試劑盒對CD8+T淋巴細胞進行磁分離。分離的CD8+T淋巴細胞在添加10%FBS、IL-2（10 ng/ml）和β-巰基乙醇（50μmol/L）的RPMI1640培養液中培養。

1.2.2 qPCR檢測膠質瘤患者腫瘤和癌旁組織EGFR表達TRIzol試劑提取患者組織總RNA，逆轉錄試劑盒合成cDNA，并以此為模板進行qPCR檢測。PCR引物序列為EGFR F：5＇-TCCTTGGGAATTTGGAAATT-3＇，R：5＇-GGCATAGGAATTTTCGTAGTACAT-3＇；EGFRvⅢF：5'-GTATTGATCGGGAGAGCCG-3＇，R：5'-GTGGAGATCGCCACTGATG-3'；β-actin F：5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3'，R：5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3'。反應條件為94℃預變性1 min，95℃變性5 s，60℃復性30 s，72℃延伸60 s，共38個 循 環。2-ΔΔCt計 算EGFR和EGFRvⅢmRNA相對表達。

1.2.3 多肽疫苗制備CTP原始序列為YGRRARRRRRR。為提高CTP溶解度，采用G代替最初的Y，CTP最終序列為GGRRARRRRRRRK。EGFRvⅢ突變肽V2序列為LEEKKGNYVVTDH。FITC通過ACP接頭置于偶聯肽N-末端。所有肽由上海吉爾多肽有限公司合成，經高效液相色譜柱純化得到純度＞95%的多肽。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察CTP-V2胞質定位情況提前12 h在24孔板中接種5×104個DCs，用不同濃度FITC標記的多肽處理DCs，孵育時間分別為15 min、30 min和60 min。孵育結束后，PBS緩沖液沖洗3次，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 流式細胞術檢測負載多肽疫苗的DCs對CD8+T細胞的激活T細胞增殖實驗：采用1μmol/L CFSE與CD8+T細胞37℃孵育15 min，標記CD8+T細胞。將負載多肽疫苗的DCs作為靶細胞，與CFSE標記的CD8+T細胞按2∶1效靶比孵育3 d，收集細胞，抗CD8抗體染色，流式細胞儀檢測CFSE稀釋度。T細胞激活標志物CD69檢測：將負載多肽疫苗的DCs作為靶細胞，與CD8+T細胞按2∶1效靶比孵育24 h，收集細胞，抗CD8及抗CD69抗體染色，流式細胞儀檢測CD69表達。

1.2.6 多肽疫苗的體內抑瘤實驗 小鼠皮下注射1×105個GL261-Luc細胞，待腫瘤長至80 mm3時隨機分為4組進行實驗，每組5只。每7 d瘤周注射20 mg/kg多肽疫苗，每5 d測量腫瘤體積，第25天對小鼠腫瘤進行活體成像，處死小鼠后稱量腫瘤質量。小鼠腫瘤體積=1/2長×寬2。

1.2.7 免疫組織化學檢測腫瘤組織CD3+T細胞浸潤 小鼠腫瘤組織經甲醛固定，梯度乙醇脫水及石蠟包埋后，切片（5μm），脫蠟水合，檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復，5%山羊血清室溫封閉1 h，加入抗CD3抗體（1∶100）4℃孵育過夜，加入山羊抗兔二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，DAB顯色5 min，蘇木精復染，顯微鏡下觀察，Image Pro Plus軟件對陽性細胞數進行定量分析。

1.3 統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行統計學處理。計量數據采用±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFRvⅢ是腦膠質瘤的腫瘤標志物及預后指標qRT-PCR檢測腦膠質瘤患者腫瘤和癌旁組織總EGFR mRNA表達，結果表明：腫瘤組織EGFR mRNA水平顯著高于癌旁組織（圖1A，P＜0.001）。此外，EGFRvⅢ和野生型EGFR在腦膠質瘤組織中的表達呈正相關（R=0.58，圖1B）。腦膠質瘤患者生存分析表明，EGFRvⅢ過表達或EGFR和EGFRvⅢ同時過表達顯示不良預后（圖1C）。

圖1 EGFRvⅢ是膠質瘤的腫瘤標志物和預后指標Fig.1 EGFRvⅢis a tumor marker and prognostic indicator of glioma

2.2 CTP融合多肽可有效定位于DCs細胞質EGFRvⅢ是EGFR胞外區缺失突變體，在N端6～273個氨基酸處形成1個新的LEEKKGNYVVTDH（V2）表位（圖2A）。將CTP與突變肽V2進行偶聯，分析CTP-V2偶聯肽是否具有胞質定位功能，倒置熒光顯微鏡結果表明，以10 mol/L CTP-V2與DCs共孵育30 min，轉導效率最高（圖2D）。

圖2 DCs體外攝取CTP-V2的能力Fig.2 Validating uptake capability of CTP-V2 by DCs in vitro

2.3 負載CTP-V2的DCs可顯著激活CD8+T細胞將負載CTP-V2的DCs與CD8+T細胞共孵育（圖3A），CFSE稀釋實驗表明，負載CTP-V2的DCs較負載V2的DCs可顯著增強CD8+T細胞增殖（P＜0.000 1，圖3B、C）。此外，流式細胞術檢測CD8+T細胞表面激活標志物CD69表達結果顯示，CTP-V2組CD8+T細胞表面CD69表達顯著高于V2組（P＜0.000 1，圖3D、E）。

圖3 負載CTP-V2的DCs刺激后CD8+T細胞激活能力Fig.3 Activated capacity of CD8+T cells after stimulated with DCs loaded with CTP-V2

2.4 CTP-V2顯著抑制小鼠腦膠質移植瘤體內增殖 建立小鼠腦膠質瘤細胞皮下移植瘤模型評估CTP-V2對腦膠質瘤的抗腫瘤活性，活體成像結果顯示，CTP-V2治療組小鼠腫瘤顯著小于V2治療組（圖4A）。瘤體積監測結果也顯示，CTP-V2治療組腫瘤生長速度顯著低于V2治療組（P＜0.01，圖4B）。此外，瘤重結果也表明，CTP-V2治療組腫瘤質量較V2治療組更?。≒＜0.01，圖4C）。

圖4 CTP-V2體內抗腫瘤活性Fig.4 Anti-tumor activity of CTP-V2 in vivo

2.5 CTP-V2顯著增強T細胞浸潤與腫瘤細胞凋亡 免疫組化結果顯示，CTP-V2治療組CD3+T細胞顯著多于V2治療組（P＜0.001，圖5A、B），說明CTPV2治療組腫瘤組織較V2治療組出現明顯淋巴細胞浸潤。此外，TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡水平，結果顯示：CTP-V2治療組TUNEL陽性染色細胞數明顯多于V2治療組（P＜0.000 1，圖5C、D）。

圖5 腫瘤免疫浸潤和細胞凋亡Fig.5 Tumor immune infiltration and apoptosis

3 討論

近年多肽疫苗被用于刺激宿主免疫系統，激活對感染性或非感染性疾病的適應性免疫應答，其中新抗原疫苗在癌癥治療領域的潛力逐漸凸顯。哈佛大學的CATHERINE WU團隊采用新抗原疫苗治療6例高復發風險的黑色素瘤患者，其中4例治療后2年內未復發，重新引起了研究者對腫瘤疫苗的興趣［16］。

EGFRvⅢ是典型的新抗原，編碼EGFRvⅢ的肽鏈是一種理想的多肽疫苗，但單一的EGFRvⅢ無法引起顯著的抗腫瘤免疫應答，需聯合佐劑或對其進行修飾［17-18］。近期研究表明，胞漿轉導肽修飾可能是增強治療性或預防性多肽疫苗免疫原性的有效策略，因為這種策略可介導多肽疫苗定位于抗原提呈細胞的胞漿中，利用交叉遞呈優勢誘導細胞免疫應答［19］。

本研究中，EGFRvⅢ編碼的多肽疫苗與胞漿轉導肽融合，體外實驗中，為研究抗原提呈細胞（如DCs）對疫苗的攝取，采用FITC標記的疫苗示蹤DCs攝取抗原的效率，觀察到CTP-V2能有效被DCs攝取，且定位于胞質。這種能夠直接定位于DCs細胞質的性質可更好地誘導交叉遞呈過程。課題組發現DC/CTP-V2組與CD8+T細胞共孵育后，T細胞增殖能力顯著增強，CD69表達顯著升高，提示存在交叉遞呈。體內研究中，CTP介導的多肽疫苗可顯著激活小鼠抗腫瘤免疫應答，抑制膠質瘤生長。

為達到臨床應用效果，有研究采用患者DCs負載抗原，形成DCs疫苗，對患者進行治療。與傳統的抗原負載工具，如PTDS和納米顆粒相比，CTP可將抗原肽直接攜帶到DCs胞漿，是一種安全的外源抗原遞送工具［20］。因此未來研究中，課題組將繼續探索DCs體外負載CTP-V2后對膠質瘤的治療作用。

綜上，本研究報道了一種采用CTP介導的多肽疫苗誘導膠質瘤特異性抗腫瘤免疫應答，這種方法基于CTP強大的細胞質定位能力，使外源抗原內源化，從而誘導特異性和持久的細胞免疫應答。EGFRvⅢ-GL261移植瘤模型中，CTP-V2可有效誘導細胞免疫以及表現出較強的抗腫瘤能力，顯著增強T細胞向腫瘤組織浸潤的能力。因此，CTP-V2可能是治療膠質瘤的一種新策略。