干擾lncRNA DICER1-AS1通過調控miR-206抑制肺癌細胞增殖、遷移

高旦華 蔣紅芳 蔡漢炯（杭州市蕭山區中醫院呼吸內科，杭州 311201）

近年來，肺癌的發病率呈逐年上升趨勢，非小細胞肺癌是肺癌的一大種類，隨著靶點及分子靶向藥物的不斷研發，分子靶向治療已成為晚期非小細胞肺癌患者一種重要治療手段［1-3］。研究表明lncRNA失調與肺癌在內的多種腫瘤的進展密切相關，lncRNA已被證明是潛在的生物標志物和癌癥診斷和治療的靶標［4-5］。研究報道肺癌組織中lncRNA DICER1-AS1高表達可能是促進腫瘤發生發展的重要因素［6］。lncRNA DICER1-AS1在骨肉瘤細胞中高表達，敲低lncRNA DICER1-AS1抑制了骨肉瘤細胞的增殖、遷移、侵襲［7］。然而lncRNA DICER1-AS1對肺癌細胞增殖、遷移的影響及機制還尚不清楚。miR-206定位于人類第6號染色體，大量研究顯示miR-206的表達失調與腫瘤的進展密切相關［8］。如miR-206在肺腺癌組織中低表達，miR-206過表達可以抑制A549的遷移和侵襲［9］。miR-206通過負向調節冠蛋白1C（coronin-1C，CORO1C）抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲［10］。因此，本實驗旨在研究lncRNA DICER1-AS1對肺癌細胞增殖、遷移的影響及機制是否與miR-206有關。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取杭州市蕭山區中醫院2018年1月至2020年1月收治的23例肺癌患者，通過手術取其癌組織及相應的癌旁組織，所有患者經病理檢測確診為肺癌，且具有完整臨床病理資料，所有患者均知情同意。

1.1.2 細胞與主要試劑A549細胞（貨號：CCL-185，美國ATCC）；RPMI1640培養基（貨號：61870-127，美國Gibco公司）；Trizol試劑（貨號：9108-1）、熒光定量試劑盒（貨號：DRR420A，日本TaKaRa公司）；MTT試劑盒（貨號：1000936-5，上海賓智生物科技有限公司）；Transwell小室（貨號：354480，美國BD公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號：D0010）、BCA試劑盒（貨號：PC0050，北京索萊寶科技有限公司）；RIPA蛋白裂解液（貨號：R40010，上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組 取對數生長期A549細胞，將si-NC、si-lncRNA DICER1-AS1分別轉染至A549細胞中，記為si-NC組、si-lncRNA DICER1-AS1組；將si-lncRNA DICER1-AS1分 別 與anti-miR-NC、antimiR-206共轉染至A549細胞中，記為si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-NC組、si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-206組。

1.2.2 RT-qPCR檢測lncRNA DICER1-AS1和miR-206的表達水平 提取組織及細胞總RNA，反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明進行PCR，PCR反應體系：2μl反轉錄產物、10μl SYBR Green Mix、上下游引物各0.5μl，補水至20μl；反應條件為95℃預變性2 min，95℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環；以GAPDH和U6為內參，相對表達量用2-ΔΔCt法計算。

1.2.3 MTT檢測細胞存活率 收集各組培養48 h的細胞，按試劑盒說明操作，用酶標儀檢測570 nm處吸光度（OD）值。細胞存活率（%）=實驗組OD/對照組OD×100%。

1.2.4 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力 各組細胞制成細胞懸液，接種于6孔板，培養2周，分別用甲醇固定和吉姆薩染色，在低倍光學顯微鏡下計數＞50個細胞的集落。

1.2.5 Transwell檢測細胞遷移 將細胞無血清培養12 h，Transwell小室上室添加200μl細胞懸液，培養24 h后，用多聚甲醛固定和結晶紫染色，顯微鏡下拍照并計數遷移細胞數。

1.2.6 熒光素酶報告實驗檢測lncRNA DICER1-AS1和miR-206的靶向關系Starbase預測顯示lnc-RNA DICER1-AS1和miR-206存在結合位點。構建lncRNA DICER1-AS1的野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-lncRNA DICER1-AS1和MUT-lncRNA DICER1-AS1，將其分別與miR-NC和miR-206共轉染至A549細胞中。按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot法檢測Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達 提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE，轉膜，封閉，加入稀釋好的一抗（1∶500），4℃過夜，倒掉一抗，TBST洗膜，加入二抗（1∶3 000），室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL，暗室下顯影、定影。檢測蛋白條帶灰度值，蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值。

1.3 統計學分析SPSS20.0軟件進行統計學分析，計量資料用±s表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-qPCR檢測lncRNA DICER1-AS1、miR-206在肺癌組織及各組處理A549中的表達及其靶向關系驗證 肺癌組織中lncRNA DICER1-AS1表達水平高于癌旁組織，miR-206表達水平低于癌旁組織（P＜0.05，表1）。Starbase預測顯示lncRNA DICER1-AS1與miR-206存在結合位點（圖1A）。miR-206與WT-lncRNA DICER1-AS1共轉染的細胞熒光素酶活性顯著低于miR-NC與WT-lncRNA DICER1-AS1共轉染的細胞（P＜0.05，圖1B）；與si-NC組相比，si-lncRNA DICER1-AS1組lncRNA DICER1-AS1表達水平降低，miR-206表達水平升高（P＜0.05），與si-lncRNA DICER1-AS1組和si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-NC組相比，si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-206組miR-206表達水平降低（P＜0.05，圖1C、D）。

表1 lncRNA DICER1-AS1、miR-206在肺癌組織中的表達（±s，n=23）Tab.1 Expressions of lncRNA DICER1-AS1 and miR-206 in lung cancer tissues（±s，n=23）

表1 lncRNA DICER1-AS1、miR-206在肺癌組織中的表達（±s，n=23）Tab.1 Expressions of lncRNA DICER1-AS1 and miR-206 in lung cancer tissues（±s，n=23）

Note：Compared with paracancer group，1）P＜0.05.

Groups Paracancer Lung cancer tissue tP lncRNA DICER1-AS1 1.01±0.13 3.21±0.251）37.443 0.000 miR-206 1.00±0.13 0.24±0.041）26.797 0.000

圖1 lncRNA DICER1-AS1靶向調控miR-206及miR-206表達的檢測Fig.1 Detection of miR-206 and miR-206 expression regulated by lncRNA DICER1-AS1

2.2 MTT法及克隆形成實驗檢測各組處理A549增殖的影響 與si-NC組相比，si-lncRNA DICER1-AS1組細胞存活率降低，克隆形成數減少（P＜0.05），與si-lncRNA DICER1-AS1組和si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-NC組 相 比，si-lncRNA DICER1-AS1+antimiR-206組細胞存活率升高，克隆形成數增加（P＜0.05，圖2）。

圖2 各組處理A549細胞存活率及克隆形成數的檢測Fig.2 Detection of survival rate and colony forming number of A549 cells in each group

2.3 Transwell檢測各組處理A549遷移的影響 與si-NC組相比，si-lncRNA DICER1-AS1組遷移細胞數降低，Ki67、N-cadherin表達水平降低，E-cadherin表達水平升高（P＜0.05），與si-lncRNA DICER1-AS1組和si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-NC組相比，si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-206組遷移細胞數增加，Ki67、N-cadherin表達水平升高，E-cadherin表達水平降低（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組處理A549遷移細胞數目及Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達的影響Fig.3 Number of migration cells and expressions of Ki67，N-cadherin and E-cadherin protein in A549 treated by each group

3 討論

肺癌是當今世界上病死率和發病率都非常高的惡性腫瘤，生物靶向藥物治療、手術治療和放療、化療是肺癌的重要治療手段，且其聯合治療效果較好。研究肺癌的發生發展分子機制，尋找精準的靶點對生物靶向藥物的研發具有重要意義［11-13］。研究報道lncRNA DICER1-AS1在骨肉瘤細胞中上調表達，lncRNA DICER1-AS1高表達與患者臨床分期和遠處轉移顯著相關，與骨肉瘤患者的臨床預后不良也有關，可作為骨肉瘤的潛在預后生物標志物［14］。lncRNA DICER1-AS1在肺癌中也高表達［6］。本實驗結果顯示肺癌組織中lncRNA DICER1-AS1表達水平升高，與既往研究結果一致。為進一步研究lncRNA DICER1-AS1對肺癌細胞增殖、遷移的影響，本實驗將lncRNA DICER1-AS1干擾表達載體轉染至A549細胞中，結果顯示細胞存活率降低，克隆形成數降低，遷移細胞數降低，Ki67、N-cadherin表達水平降低，E-cadherin表達水平升高。Ki67是細胞增殖核抗原，與細胞增殖相關。研究表明Ki67與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結轉移及術后復發呈負相關，是老年肺腺癌的獨立預后因素［15］。N-cadherin、E-cadherin是上皮-間質轉化的相關標志物，其表達水平與腫瘤的浸潤轉移密切相關，研究表明下調N-cadherin和上調E-cadherin的表達可抑制肺癌細胞侵襲和轉移［16］。因此，本實驗表明干擾lncRNA DICER1-AS1可抑制肺癌細胞增殖和遷移。

研究表明miRNA參與肺癌的致癌性和生物學行為［17］。如上調miR-206表達可抑制非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲［18］。且研究報道lncRNA MALAT1通過靶向miR-206和AKT/mTOR信號傳導可促進非小細胞肺癌的遷移和侵襲［19］。lncRNA SNHG14通過miR-206/6-磷酸葡萄糖脫氫酶途徑促進非小細胞肺癌的發展［20］。以上結果表明miR-206高表達可抑制非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲，且lncRNA可通過調控miR-206影響癌細胞增殖、遷移。本實驗通過在線軟件預測顯示，lncRNA DICER1-AS1與miR-206存在結合位點，且雙熒光素酶報告實驗表明lncRNA DICER1-AS1靶向調控miR-206的表達。干擾lncRNA DICER1-AS1表達，miR-206表達水平升高；且抑制miR-206表達可逆轉干擾lncRNA DICER1-AS1對肺癌細胞增殖、遷移的抑制作用。

綜上所述，干擾lncRNA DICER1-AS1可能通過上調miR-206表達抑制肺癌細胞增殖、遷移。