lncRNA NEAT1靶向miR-497-5p對胰腺癌細胞增殖、凋亡及上皮-間質轉化的影響

于文昊 王海久（青海大學附屬醫院肝膽胰外科，西寧 810000）

胰腺癌是臨床常見消化系統惡性腫瘤，近30年來其發病率在全球范圍內呈上升趨勢，且病死率較高，其早期癥狀不明顯，缺乏特異性篩查指標，80%患者確診時多已是中晚期，僅5%左右患者進行手術治療，但五年生存率不足5%［1-3］。因此，探尋胰腺癌新型生物治療靶標已成為臨床研究熱點。長鏈非 編 碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一種反義RNA分子，不具有蛋白編碼能力，能與靶基因非編碼區特異性結合，調節基因轉錄和表達而發揮促癌或抑癌作用［4］。核富集轉錄體1（nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1）是lncRNAs家族成員之一，研究顯示，其對多種惡性腫瘤如甲狀腺癌、肝癌、舌鱗狀細胞癌等細胞生物學行為均具有調控作用［5-7］。miR-497-5p屬于miRNAs家族重要一員［8］，姜達偉等［9］研究顯示，過表達miR-497-5p能夠誘導胰腺癌細胞周期阻滯進而抑制細胞增殖。XIA等［10］研究顯示，NEAT1靶向下調miR-497-5p表達促進胃癌細胞增殖并抑制凋亡。目前，有關NEAT1能否調控miR-497-5p影響胰腺癌細胞生物學行為的研究鮮有報道，因此本研究探討NEAT1與miR-497-5p對胰腺癌細胞增殖、凋亡等的影響，以期為臨床尋找胰腺癌新型生物治療靶點提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人胰腺癌PANC-1細胞（bio-51676）購自北京百歐博偉生物技術有限公司。

1.1.2 試劑與儀器DMEM培養基（3-2001）、蛋白提取試劑盒（BC3711-50T）、LipofectamineTM3000轉染試劑盒（EF010-E）購自美國艾美捷（武漢）科技有限公司；CCK-8試劑盒（CA1210-500T）、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（WK304）、反轉錄試劑盒（RP1105-100T）、AceQqPCR SYBR Green Mix（ALH185）、Trizol Reagent核酸分離試劑（YT526）、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（KFS303-HUV）購自北京百奧萊博科技有限公司；靶向NEAT1的特異性siRNA（NEAT1-siRNA）及無關序列siRNA-NC由上海普邁生物科技有限公司設計合成；miR-497-5p-inhibitor及相應陰性對照inhibitor-NC由百奧邁科生物技術有限公司合成；兔抗人細胞增殖相關核抗原（MKI67 Affinity Purified Polyclonal Ab，Ki-67）（100130-MM21）、B淋巴 細 胞 瘤 基 因-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（FTB3598S）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（ATA25287）、E-鈣黏附蛋白（E-cadherin）抗體（貨號ACRO）、間質標志物波形蛋白（Vimentin）（貨號K26866-PGZ）、N-鈣黏附蛋白（N-cadherin）抗體（貨號M00403-FCZ）、β-actin（ABP57456）多克隆抗體、山羊抗兔HRP（SE12-0.1）二抗均購自武漢益普生物科技有限公司；二氧化碳細胞培養箱（型號：BBD6220）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；酶標儀（型號：ELx800）、熒光定量PCR儀（型號：C1000）購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀（型號：CytoFLEX）購自美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 取PANC-1細胞解凍，復蘇，置于含10%滅活胎牛血清（FBS）+DMEM培養基，37℃、5%CO2培養箱中培養，每2～3 d換液，無菌操作，細胞已長滿（達80%～90%）時進行傳代培養。

1.2.2 細胞瞬時轉染及分組處理 取1.2.1對數生長期的PANC-1細胞接種于24孔板（2.5×104個/孔），培養24 h后，更換無FBS的培養液，對細胞進行轉染并分組：①空白對照組（NG組）：細胞不做特殊處理；②陰性轉染組（siRNA-NC組）：采用LipofectamineTM3000將NEAT1-siRNA轉染至PANC-1細胞中；③沉默NEAT1組（NEAT1-siRNA組）：采用LipofectamineTM3000將NEAT1-siRNA轉染至PANC-1細胞中；④共轉染組（NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor組）：采用LipofectamineTM3000將NEAT1-siRNA和miR-497-5p-inhibitor序列共轉染。用含10%滅活FBS+DMEM培養液繼續培養細胞48 h。嚴格按照轉染試劑盒說明書操作，收集各組細胞用于后續實驗。

1.2.3 實時定量聚合酶鏈反應檢測NEAT1、miR-497-5p水平TRIzol法提取1.2.2各組培養48 h的PANC-1細胞總RNA并測定濃度。以RNA為模板、PrimeScript RT reagent試劑盒說明書為操作標準進行逆轉錄合成cDNA。體系20μl：ULtraSYBR mixture（10.0μl）、模板cDNA（2.0μl）、上下游引物（各2.0μl）、去離子純化水（4.0μl）；93℃30 s、93℃5 s、65℃30 s，40個循環。引物序列詳見表1，由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設計并合成。采用2-ΔΔCt方法計算NEAT1、miR-497-5p水平相對表達量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 CCK-8法檢測各組PANC-1細胞增殖能力取1.2.2各組培養48 h后的PANC-1細胞，消化，接種至24孔板（2.5×104個/孔），繼續培養48 h，嚴格按照CCK-8試劑盒說明書加入CCK-8試劑，繼續培養2 h，檢測490 nm處各孔細胞光密度（optical density，OD）值，計算細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞術檢測各組PANC-1細胞凋亡率取1.2.2各組培養48 h后的PANC-1細胞接種于24孔板中（2.5×105個/孔），按照Annexin-V FITC/PI試劑盒說明書處理細胞；加5μl碘化丙啶（PI）+5μl Annexin V-FITC混勻，染色，稀釋，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.2.6 Western blot檢測增殖、凋亡及上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）標志蛋白表達情況 以RIPA液裂解細胞，提取總蛋白并檢測濃度及純度，行10%SDS-PAGE電泳、轉膜，以5%脫脂牛奶封閉，加入一抗Ki-67、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及內參β-actin，稀釋比均為1∶500，4℃過夜，清洗，加入HRP標記的山羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育1 h。分析各蛋白相對表達量。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗 數據庫（Starbase）顯示NEAT1與miR-497-5p核苷酸存在結合位點，根據miR-497-5p與NEAT1-3'UTR結合位點的預測結果，采用PCR技術擴增NEAT1-3'UTR序列中包含與miR-497-5p存在結合位點的片段，并插入到熒光素酶pGL4載體中，構建NEAT1野生型質粒（NEAT1-WT），并利用基因突變技術將個別結合位點序列突變，構建突變型質粒（NEAT1-MT）。使用LipofectamineTM3000將NEAT1-WT、NEAT1-MT分別與miR-497-5p-inhibitor-NC、miR-497-5p-inhibitor共轉染于PANC-1細胞，分別為miR-497-5p-inhibitor-NC-NEAT1-WT組、miR-497-5p-inhibitor-NEAT1-WT組、miR-497-5p-inhibitor-NC-NEAT1-MT組、miR-497-5p-inhibitor-NC-NEAT1-MT組，轉染48 h后，用PBS洗滌細胞，加入RIPA裂解液（250μl）于室溫搖床中搖晃15 min裂解細胞，收集裂解液，加入50μl熒光素酶檢測試劑Ⅱ，以自動熒光素酶檢測儀測定熒光強度A，之后加入Stop＆Glo，測定熒光強度B，以A/B表示熒光素酶相對活性。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0分析數據，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組PANC-1細胞NEAT1、miR-497-5p水平比較 與NG組、siRNA-NC組比較，NEAT1-siRNA組PANC-1細胞NEAT1水平顯著降低（P＜0.05），miR-497-5p水平顯著升高（P＜0.05）；與NEAT1-siRNA組比較，NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor組PANC-1細胞NEAT1水平差異無統計學意義（P＞0.05），miR-497-5p水平顯著降低（P＜0.05，表2）。

表2 各 組PANC-1細 胞NEAT1、miR-497-5p水 平 比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of NEAT1 and miR-497-5p levels in PANC-1 cells of each group（±s，n=6）

表2 各 組PANC-1細 胞NEAT1、miR-497-5p水 平 比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of NEAT1 and miR-497-5p levels in PANC-1 cells of each group（±s，n=6）

Note：Compared with NG group，1）P＜0.05；compared with siRNA-NC group，2）P＜0.05；compared with NEAT1-siRNA group，3）P＜0.05.

Groups NG siRNA-NC NEAT1-siRNA NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor F P NEAT1/β-actin 0.99±0.15 1.00±0.15 0.55±0.081）2）0.53±0.071）2）271.020 0.000 miR-497-5p/U6 1.01±0.16 0.98±0.15 1.55±0.231）2）1.20±0.181）2）3）130.270 0.000

2.2 各組PANC-1細胞增殖情況比較 與NG組、siRNA-NC組比較，NEAT1-siRNA組PANC-1細胞增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）；與NEAT1-siRNA組比較，NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor組PANC-1細胞增殖抑制率顯著降低（P＜0.05，表3）。

表3 各組PANC-1細胞增殖情況比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of PANC-1 cell proliferation in each group（±s，n=6）

表3 各組PANC-1細胞增殖情況比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of PANC-1 cell proliferation in each group（±s，n=6）

Note：Compared with NG group，1）P＜0.05；compared with siRNA-NC group，2）P＜0.05；compared with NEAT1-siRNA group，3）P＜0.05.

Groups NG siRNA-NC NEAT1-siRNA NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor F P Cell proliferation inhibition rate（%）0.00 0.08±0.01 22.87±3.431）2）15.12±2.271）2）3）939.753 0.000

2.3 各組PANC-1細胞凋亡情況比較 與NG組、siRNA-NC組比較，NEAT1-siRNA組PANC-1細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與NEAT1-siRNA組比較，NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor組PANC-1細 胞凋亡率顯著降低（P＜0.05，圖1、表4）。

表4 各組PANC-1細胞凋亡情況比較（±s，n=6）Tab.4 Comparison of PANC-1 cell apoptosis in each group（±s，n=6）

表4 各組PANC-1細胞凋亡情況比較（±s，n=6）Tab.4 Comparison of PANC-1 cell apoptosis in each group（±s，n=6）

Note：Compared with NG group，1）P＜0.05；compared with siRNA-NC group，2）P＜0.05；compared with NEAT1-siRNA group，3）P＜0.05.

Groups NG siRNA-NC NEAT1-siRNA NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor FP Apoptosis rate（%）15.69±2.35 17.01±2.55 40.05±6.061）2）27.88±4.191）2）3）558.343 0.000

圖1 各組PANC-1細胞凋亡情況比較Fig.1 Comparison of PANC-1 cell apoptosis in each group

2.4 各組PANC-1細胞增殖、凋亡及EMT相關蛋白表達比較 與NG組、siRNA-NC組比較，NEAT1-siRNA組PANC-1細胞Ki-67、Bcl-2、N-cadherin、Vimentin蛋白表達顯著降低（P＜0.05），Bax、E-cadherin蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與NEAT1-siRNA組比較，NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor組PANC-1細胞Ki-67、Bcl-2、N-cadherin、Vimentin蛋白表達顯著升高（P＜0.05），Bax、E-cadherin蛋白表達顯著降低（P＜0.05，圖2、表5）。

表5 各組PANC-1細胞增殖、凋亡及EMT相關蛋白表達比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of proliferation，apoptosis and EMT related protein expressions of PANC-1 cells in each group（±s，n=6）

表5 各組PANC-1細胞增殖、凋亡及EMT相關蛋白表達比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of proliferation，apoptosis and EMT related protein expressions of PANC-1 cells in each group（±s，n=6）

Note：Compared with NG group，1）P＜0.05；compared with siRNA-NC group，2）P＜0.05；compared with NEAT1-siRNA group，3）P＜0.05.

Groups NG siRNA-NC NEAT1-siRNA NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor FP Ki-67/β-actin 1.18±0.18 1.20±0.19 0.57±0.091）2）0.85±0.131）2）3）191.436 0.000 Bax/β-actin 0.33±0.04 0.35±0.05 0.97±0.161）2）0.67±0.111）2）3）699.870 0.000 Bcl-2/β-actin 0.95±0.14 0.96±0.15 0.30±0.051）2）0.71±0.111）2）3）305.653 0.000 E-cadherin/β-actin 0.55±0.08 0.58±0.09 1.17±0.251）2）0.87±0.131）2）3）273.400 0.000 N-cadherin/β-actin 1.21±0.18 1.19±0.19 0.52±0.081）2）0.79±0.121）2）3）240.613 0.000 Vimentin/β-actin 1.17±0.18 1.19±0.19 0.60±0.091）2）0.83±0.121）2）3）178.955 0.000

圖2 各組PANC-1細胞增殖、凋亡及EMT相關蛋白表達比較Fig.2 Comparison of proliferation，apoptosis and EMT related protein expression of PANC-1 cells in each group

2.5 雙熒光素酶報告基因檢測NEAT1對miR-497-5p的轉錄調控Starbase（http：//starbase.sysu.edu.cn/degradomeRNA.php？source=mRNA）預測結果顯示，NEAT1與miR-497-5p基因序列存在結合位點，見圖3。熒光素酶報告基因實驗結果顯示，轉染NEAT1 WT的實驗中，miR-497-5p-inhibitor-NEAT1-WT組熒光素酶活性（1.37±0.21）顯著高于miR-497-5p-inhibitor-NC-NEAT1-WT組（1.03±0.15），（P＜0.05，圖4）。

圖3 NEAT1與miR-497-5p基因靶向關系Fig.3 Targeting relationship between NEAT1 and miR-497-5p gene

圖4 熒光素酶實驗結果Fig.4 Results of luciferase experiment

3 討論

胰腺癌是消化系統惡性腫瘤，具有發病隱匿、侵襲性強特點，導致大多數患者確診時已是中晚期［11］。目前手術及化療手段是臨床治療胰腺癌的主要手段，但手術對于浸潤程度深的患者有較大風險，同時療效有一定局限性，而腫瘤細胞對化療藥物耐藥性又限制了化療藥物的廣泛應用及療效。

NEAT1是新近發現的一個lncRNA，能夠參與多種基因轉錄調控，研究表明，其作為癌基因參與多種腫瘤發生發展［12］。郭春芳等［13］研究顯示，NEAT1在卵巢癌組織中異常高表達可能是卵巢癌潛 在 治 療 靶 點。WANG等［14］研 究 顯 示，過 表 達NEAT1顯著促進子宮內膜癌細胞增殖、侵襲等。細胞增殖及凋亡失衡是腫瘤發生發展的關鍵，而EMT是指上皮細胞在正常生理及病理特征下向間質細胞表型的轉變過程，是腫瘤細胞發生遷移和侵襲的關鍵步驟［15-16］。其中上皮細胞標志蛋白E-cadherin及間質細胞標志蛋白N-cadherin、Vimentin是EMT標志蛋白，E-cadherin表達下調及N-cadherin、Vimentin表達上調，胞間黏附作用減弱，進一步促使癌細胞向周邊正常組織發生侵襲、轉移［17-18］。本研究結果顯示，與NG組、siRNA-NC組比較，NEAT1-siRNA組PANC-1細胞增殖抑制率、凋亡率、Bax、Ecadherin蛋白表達顯著升高，NEAT1水平及Ki-67、Bcl-2、N-cadherin、Vimentin蛋白表達顯著降低。與既往腫瘤研究中表達模式一致，說明沉默NEAT1表達可能抑制胰腺癌細胞增殖、EMT過程并誘導細胞凋亡。miR-497-5p是一種單鏈小分子RNA，位于腫瘤易突變區域人類染色體17q13.1，在多種腫瘤中異常低表達［19］。LIU等［20］研究顯示，miR-497可能通過抑制血管內皮生長因子-A表達抑制胰腺癌細胞增殖、血管生成和轉移能力。本研究結果顯示，與NG組、siRNA-NC組比較，NEAT1-siRNA組PANC-1細胞miR-497-5p水平顯著升高，當在轉染NEAT1-siRNA基礎上抑制miR-497-5p表達后，沉默NEAT1表達抑制PANC-1細胞增殖并誘導細胞凋亡能力減弱，說明沉默NEAT1表達可能通過上調miR-497-5p表達發揮抑癌作用。研究發現，NEAT1可對miR-497-5p發揮負調控作用促進胃癌細胞增殖并抑制凋亡［10］。本研究經生物信息學預測網站得知NEAT1與miR-497-5p基因序列存在結合位點，且經雙熒光素酶報告實驗證實，miR-497-5p-inhibitor-NEAT1-WT組熒光素酶活性顯著高于miR-497-5pinhibitor-NC-NEAT1-WT組。以上研究結果表明，沉默NEAT1表達可能靶向上調miR-497-5p表達，抑制胰腺癌細胞增殖及EMT過程，并誘導細胞凋亡。

綜上所述，沉默lncRNA NEAT1表達能抑制胰腺癌細胞增殖及EMT過程，并誘導細胞凋亡，可能是通過靶向上調miR-497-5p實現的。然而胰腺癌發生發展是多因素的復雜過程，關于其細胞增殖、凋亡等生物學惡性行為進展中lncRNA NEAT1對下游靶基因或相關通路的調控作用仍需深入探索。