基于分子影像學評價HMGB1因子在家兔胰腺癌發生發展機制中的應用研究

郝利國 榮 瑋 李 崢 張春晶 崔紅升

(齊齊哈爾醫學院醫學技術學院影像設備與技術學教研室 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

黑龍江省省屬高等學?；究蒲袠I務費科研項目，項目名稱：基于分子影像學評價HMGB1因子在家兔胰腺癌發生發展機制中的應用研究，項目編號：2018-KYYWF-0085

胰腺癌是一種惡性程度高，早期診斷困難的腫瘤，近年來其發病年齡呈現明顯年輕化趨勢。高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box 1, HMGB1)是與細胞損傷相關的一種分子[1-4]，是導致慢性炎癥和修復性反應的重要原因。研究表明HMGB1與多種腫瘤信號相關[5]。HMGB1的過度表達可使獲得腫瘤表型的細胞避免凋亡，從而導致腫瘤的發生。HMGB1在前列腺癌、結腸癌、肺癌以及食道癌等均高度表達[6-7]。以HMGB1為特異性靶點，研究其在胰腺癌進展中的作用，并闡明HMGB1是否通過影響細胞增殖/凋亡、血管生成、免疫調節等控制腫瘤進展，利用分子影像學評價胰腺癌細胞的HMGB1表達情況，分析HMGB1在腫瘤免疫中的調節作用，通過胰腺癌HMGB1分子功能成像[8]，評價HMGB1對胰腺癌腫瘤細胞增殖與凋亡、血管生成以及免疫微環境的影響，有望為胰腺癌的防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1.1一般資料

由齊齊哈爾醫學院動物中心提供家兔12只，成功制備模型兔 (胰腺癌) 12只，模型制備部分、MR分子成像、超聲監測部分在齊齊哈爾醫學院及附屬三院進行。

1.1.2儀器

儀器型號激光粒度測定儀Nicomp380ZLS,美國PSS透射電子顯微鏡HT-7700,日本日立粒度分析儀NICOMP-380ZLS,美國PSS核磁共振造影劑弛豫率分析成像系統EDUMR20-015V,蘇州紐邁電感耦合等離子體質譜-質譜儀ICP-MS,Agilent 770s,美國超純水系統Millipore Synergy,美國密斯博小動物活體成像儀美國珀金埃爾默熒光倒置顯微鏡AXIO OBSERVER,德國多功能酶標儀Safire2,奧地利

1.2研究方法

1.2.1 實驗方法

(1)本實驗中采用VX-2組織懸液種植的12只家兔中成瘤率為100%，穩定性較高；但采用此法瘤塊過大,且腫瘤組織在短期內難以快速建立有效血液循環,易發生液化,因此采用劑量1-5mm3的組織塊進行植入，以上模型兔在動物實驗中心標準飼養。

(2)MRI檢測，利用3.0T MR行冠狀位T2成像、軸位T2成像、彌散加權成像、波譜成像，分別在平掃和增強下獲得12只荷瘤兔的圖像。通過對圖像中感興趣區域(ROI)的分析，得到信噪比(SNR)并評估影像增強效果。

(3)超聲檢測：利用vivid 9對12只荷瘤兔超聲檢測，獲得平掃、多普勒、彈性成像等超聲數據，同時進行超聲增強檢查。

(4)探針的制備和偶聯：選取HMGB1在胰腺的特異性靶點，制作HMGB1分子探針，行MRI檢查掃描，獲得分子影像圖像。

研究表明，公路瀝青路面基層施工過程出現硬化現象的原因為：材料配置比例不合理。這里的配置材料主要指：瀝青與混凝土。如，材料配比的混凝土較多或是瀝青較少的情況下，就會導致路面結構出現凹坑與塌陷現象。

1.2.2 探針合成部分

配制0.1 mM的HAuCl4溶液備用，取適量1 mg/mL的PVP溶液于茄形瓶中，將茄形瓶放于恒溫磁力加熱攪拌器內加熱攪拌，溫度達到90℃以后，緩慢滴加銀納米粒子溶液2mL，2min后，向茄形瓶內緩慢滴加氯金酸溶液0.2ml，待溶液變化為淺藍色時，加熱并攪拌約兩分鐘。取出茄形瓶冷卻至室溫，向瓶中加入足夠的NaCl溶液產生AgCl，將溶液離心去除上清液，用1:1配置的乙醇與去離子水的混合液洗滌離心1次，再次去除上清后，加入去離子水2mL 使其充分分散。

取上述步驟制備的金納米溶液20mL，向內加入稀鹽酸，將pH值調至5.0，然后加入2mg GdCl3，混勻溶液后置于搖床上孵育1h。孵育結束后，室溫下離心10min后去除上清液。取SH-PEG-NH30mg，用20 mL碳酸鹽緩沖液(pH=8)進行溶解，使用超聲波震蕩儀器震蕩10分鐘，充分溶解PEG。然后重懸溶液，上述操作去上清后的沉淀，超聲分散10min，并加入0.1%的SDS，孵育24h，加入50 μLEDC溶液和60 μLNHS溶液活化30min，隨后加入PEG溶液中，并同時加入10uL的Cy5.5熒光分子溶液，避光置于搖床上孵育24h。去除上清液、未反應的核酸及熒光分子，用含有0.1% SDS的碳酸鹽緩沖液重懸。

1.2.3 探針基本表征

(1)透射電子顯微鏡表征：使用超聲波震蕩儀器將稀釋后的少量樣品震蕩分散均勻，然后用吸管滴加于非晶碳膜銅網上，將樣品放于透射電子顯微鏡下對納米顆粒進行表征。

(2)納米探針的水動力尺寸及表面電荷情況：將稀釋后的樣品溶液置于粒度分析儀測定去離子水動力尺寸及其表面電荷性質，計算三次測量的平均值。

(3)體外MR成像：體外弛豫率測定及MR成像，室溫下分別制備不同濃度的納米探針溶液，進行3.0T磁共振掃描，觀察T1成像情況，計算其r1值。

(4)病理采集及標本制作，影像檢查后即刻處死家兔模型，連帶腫瘤表面皮膚(用于定位)解剖取下腫瘤，縱切腫瘤，同時取下心、肝、脾、肺、腎等重要臟器。

(5)將家兔腫瘤組織切片使用Western blot法檢測HMGB1的表達情況。

1.3統計學方法

本文采用SPSS20.0(美國芝加哥SPSS Inc.)分析處理軟件對兩組實驗綜合比較結果，對照樣本分別進行多個對比分析數據處理,采用兩組差異樣本配對比較方法，采用t方法進行配對檢驗, 當P<0.05時為具有統計學意義。

2 結果

家兔在VX-2組織懸液種植后，攝食量、飲水量、毛色未見明顯異常，體重由接種VX-2前的(2.12±0.34)kg降至(1.95±0.22)kg。MRI(圖1，圖2)及超聲檢查(圖3)對腫瘤病灶的檢出率均在90%以上，不過對于早期胰腺癌的檢出率較低，注射HMGB1分子探針(圖4，圖5)后，所部獲得的分子影像圖像對于胰腺癌的檢出率明顯提升(圖6)。病理結果顯示，荷瘤兔體內的HMGB1的表達情況明顯升高。

圖1 腫瘤模型CT平掃

圖2 腫瘤模型MRI DWI掃描

圖3 腫瘤模型超聲平掃

圖4 探針不同梯度圖像

圖5 探針電鏡TEM圖像

圖6 注入探針模型橫斷位MR圖像

表1 荷瘤兔注射HMGB1分子探針前后的體重(單位：kg)

荷瘤兔處死后，分別取實驗組和對照組的臟器(肺臟、肝臟、心臟、脾臟、腎臟)，對蘇木精伊紅(H&E)染色的器官切片進行組織學評價，未發現明顯的急性病理改變。對荷瘤兔腫瘤組織切片使用Western blot法檢測HMGB1的表達情況，結果顯示，荷瘤兔腫瘤組織切片中的HMGB1相對于普通家兔含量明顯升高，且注射探針后的腫瘤分子影像圖像檢出率與HMGB1的含量成線性相關有望在分子層面實現胰腺癌的早期診斷。

3 討論

胰腺癌是一種高度惡性的消化道腫瘤，死亡率極高，研究發現HMGB的最終產物RAGE過度表達于胰腺癌細胞株MIAPaCa-2和PANC-1中，該癌株中HMGB1的表達高于癌旁組織，且蛋白表達量與與癌灶的大小及浸潤深度呈現正相關趨勢。

HMGB1是一種高度保守的非組蛋白的核蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中具有高遷移率而得名。它是一種進化上高度保守的非組蛋白DNA結合蛋白，存在于所有有核細胞中[9]。HMGB1在溶細胞死亡過程中被被動釋放，并由激活的先天免疫細胞分泌。某些翻譯后修飾的HMGB1亞型在感染和無菌炎癥條件下作為促炎介質在細胞外發揮作用。NF-KB是一種成熟的炎性轉錄因子，幾乎所有動物的細胞都可以產生。且目前尚無相關分子影像評價HMGB1在胰腺癌發生發展機制中的研究報道。HMGB1在胰腺癌中的表達及臨床意義也還不是十分明確，其在胰腺癌免疫調節中的作用也尚未確定]。高遷移率族蛋白B1-HMGB1在胰腺癌發生發展中可能具有重要作用

本研究利用磁共振和超聲兩種檢查手段，評價家兔胰腺癌模型，分析計算得出圖像的信噪比(SNR)、ADC值、對比噪聲比(CNR)、對比度和病灶基本影像信息，通過與病理以及免疫組化、Western Blot之間的相關性分析，能夠獲得腫瘤微觀病理變化及蛋白水平上的分子功能影像學表現，同時尋找HMGB1在胰腺中的特異性靶點，制作分子探針，利用MRI獲得來源于胰腺的HMGB1的分子影像，并且評價HMGB1對胰腺癌腫瘤細胞增殖與凋亡、血管生成以及免疫微環境的影響，了解胰腺癌的發生發展階段，實現胰腺癌的早期診斷，早期治療。

本研究成功建立了HMGB1探針，該探針可顯著提升胰腺癌的檢出率，具有良好的生物安全性和穩定性，有望在分子層面實現胰腺癌的早期診斷。