檸檬烯異構體的氣相色譜手性拆分和定量分析

武 鵬，石凱威，高歆越，姜宜飛，吳進龍*，王詩雨

(1.農業農村部農藥檢定所，北京 100125；2.中國農業大學理學院，北京 100193)

1 前言

檸檬烯屬于單環單萜類化合物，化學名稱為1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環己烯，具有三種同分異構體，分別為右旋檸檬烯、左旋檸檬烯和消旋檸檬烯[1，2]，不同構型的檸檬烯的生物活性存在差異[3]，目前登記的檸檬烯有效成分均為d-檸檬烯，但已報到的檸檬烯分析方法如氣相色譜法和氣相色譜-質譜聯用法[4-7]均不能對檸檬烯進行手性拆分。本文采用氣相色譜法對檸檬烯中的l-檸檬烯和d-檸檬烯進行手性拆分和定量分析，該方法操作簡便、快速、準確，分離效果好，準確度和精密度均能達到定量分析的要求。

2 試驗部分

2.1 試劑和溶液 丙酮(色譜純)；苯甲酸甲酯(分析純)；內標溶液：稱取苯甲酸甲酯0.05g(精確至0.000 2g)，置于100mL容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻，備用；d-檸檬烯標樣，已知質量分數99.0%(sigma-aldrich)；l-檸檬烯標樣，已知質量分數99.0%(sigma-aldrich)；5%d-檸檬烯可溶液劑(由某公司提供)。

2.2 儀器氣相色譜儀 Agilent 7890A，具有氫火焰離子檢測器和自動進樣器；Agilent色譜工作站；色譜柱：30m×0.25mm(id) RestekRt-βDEXse毛細管色譜柱，膜厚0.25μm。

2.3 氣相色譜操作條件 溫度(℃)：柱室溫度：初始80℃，保留15min，以20℃/min升溫至220℃，保留5min；氣化室溫度：220℃，檢測室溫度：240℃，載氣(N2)：1.0mL/min；氫氣：30mL/min，空氣：300mL/min，進樣體積：1μL，分流比：10：1，保留時間：d-檸檬烯約13.0min；l-檸檬烯約12.5min；內標物約18.3min。

d-檸檬烯標樣、l-檸檬烯標樣、內標物和5%d-檸檬烯可溶液劑的氣相色譜圖(圖1、2)。

圖1 l-檸檬烯、d-檸檬烯標樣和內標物氣相色譜圖

圖2 5%d-檸檬烯可溶液劑和內標物氣相色譜圖

2.4 測定步驟

2.4.1 標樣溶液的配制 稱取l-檸檬烯標樣0.05g(精確至0.000 2g)，置于100mL容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻；移取1.0mL上述溶液于10mL容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻；稱取d-檸檬烯標樣0.05g(精確至0.000 2g)，置于10mL容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻；移取1.5mLl-檸檬烯標準溶液和1mLd-檸檬烯標準溶液，置于10mL容量瓶中，加入2mL內標液，再用丙酮稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.4.2 試樣溶液的配制 稱取含d-檸檬烯的試樣0.1g(精確至0.000 2g)，置于10mL容量瓶中，加入2mL內標液，再用丙酮稀釋至刻度，超聲3min，搖勻，冷卻，備用。

2.4.3 測定在上述操作條件下 待儀器基線穩定后，連續注入數針標樣溶液，直至相鄰2針標樣溶液的響應值相對變化<1.5%后，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

2.4.4 計算 將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標樣溶液中d-檸檬烯(l-檸檬烯)峰面積分別進行平均。試樣中d-檸檬烯(l-檸檬烯)的質量分數ω(%)，按式(1)計算：

(1)

式中：

r1——標樣溶液中d-檸檬烯(l-檸檬烯)與內標物峰面積比的平均值；

r2——試樣溶液中d-檸檬烯(l-檸檬烯)與內標物峰面積比的平均值；

m1——標樣的質量，g；

m2——試樣的質量，g；

P——標樣中d-檸檬烯(l-檸檬烯)的質量分數，%；

n——稀釋倍數，n(l-檸檬烯)=2000/3，n(d-檸檬烯)=10。

3 結果與討論

3.1 色譜條件的選擇 因d-檸檬烯和l-檸檬烯屬于旋光異構體，且二者的沸點差異不大，采用常規的色譜柱不能進行有效拆分，且二者的碎片離子峰是一致的，采用氣相色譜-質譜聯用法也不能進行有效拆分[4-7]，本方法采用RestekRt-βDEXse手性毛細管色譜柱對檸檬烯進行拆分；依據檸檬烯物化性質，用丙酮作為溶劑溶解樣品，為了得到更好的分離效果和峰形，用不同的升溫條件在色譜柱上進行試驗，最終確定溫度(℃)：初始80℃，保留15min，以20℃/min升溫至220℃，保留5min；在該條件下，d-檸檬烯和l-檸檬烯進行了有效拆分，且與雜質能得到很好的分離，峰形對稱，基線平穩，能在短時間得到滿意的分析結果，提高了工作效率。

3.2 分析方法的線性相關性試驗 按2.4.1中標樣溶液的配制方法分別配制質量濃度為5.07、25.35、50.70、253.49、506.98、1013.96mg/L的l-檸檬烯標準溶液，質量濃度為5.08、25.41、50.83、254.13、508.27、1016.53mg/L的d-檸檬烯標準溶液，以d-檸檬烯(l-檸檬烯)的質量濃度為橫坐標，d-檸檬烯(l-檸檬烯)與內標物峰面積比為縱坐標，繪制校正曲線。試驗測得d-檸檬烯線性方程為y=1.277 95x+1.989 97，相關系數為0.996 89；l-檸檬烯線性方程為y=1.182 53x+1.774 80，相關系數為0.996 88。結果表明d-檸檬烯和l-檸檬烯在測試的質量濃度范圍內線性關系良好。

3.3 分析方法的精密度試驗 從同一產品中準確稱取5個試樣，在上述色譜操作條件下進行分析，測得d-檸檬烯的標準偏差為0.066，變異系數為0.013%，l-檸檬烯的標準偏差為0.000 17，變異系數為0.023%(表1)。

表1 分析方法的精密度試驗結果

3.4 分析方法的準確度試驗 從已知d-檸檬烯(5.20%)和l-檸檬烯(0.007 5%)質量分數的樣品中稱取5個試樣，分別加入一定量的d-檸檬烯標樣(99.0%)和l-檸檬烯標樣(99.0%)，在上述色譜操作條件下進行分析，測得d-檸檬烯的平均回收率為100.41%，l-檸檬烯的平均回收率為101.72%(表2)。

表2 分析方法的準確度試驗結果

4 結論

試驗建立了氣相色譜法手性拆分檢測d-檸檬烯和l-檸檬烯的分析方法。試驗結果表明，d-檸檬烯和l-檸檬烯在測試濃度范圍內線性關系良好，方法準確度和精密度較高，具有操作簡便、快速的特點，是產品質量控制和應用研究中較為理想的分析方法。