QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜法同時測定柿子中螺蟲乙酯及其四種代謝物殘留

陳培玉，劉俊輝，劉丹黎，吳緒金，安 莉，李 萌*，白樂高*

(1. 河南省農業科學院基地管理中心，河南 鄭州 450002；2. 河南牧業經濟學院，河南 鄭州 450002；3. 河南省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，河南 鄭州 450002)

柿子為多年生落葉喬木，柿科柿屬植物，含有大量的維生素、糖類、黃酮類、脂肪酸、酚類、微量元素等營養物質，具有很高的藥用、經濟價值。柿子生長中主要蟲害有蚧殼蟲、柿蒂蟲、柿小葉蟬等。螺蟲乙酯分子式為C21H27NO5，英文名稱為(5s，8s)-3-(2，5-dimethylphenyl)-8-methoxy-2-oxo-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-4-yl ethyl carbonate是拜耳作物科學公司研制的一種季酮酸類新型殺蟲劑[1]。螺蟲乙酯主要代謝產物有螺蟲乙酯-烯醇-葡萄糖苷(S1 Spirotetramat-enol-glucoside)、螺蟲乙酯-醇酮(S2 Spirotetramat-keto-hydroxy )、螺蟲乙酯-烯醇(S3 Spirotetramat-enol)、螺蟲乙酯-單-羥基(S4 Spirotetramat-mono-hydroxy)[2]。螺蟲乙酯作用機理主要是通過影響脂質生物合成，致蟲體死亡，從而達到防蟲治蟲目的。它是具有雙向內吸傳導特性的殺蟲劑之一，滲透進葉片后被脫脂化，可同時存在于植物韌皮部和木質部，對隱蔽性強的害蟲也有較好的防治效果。用于大豆、棉花等大田作物及常見果蔬植物體上的蚧科、粉虱、粉蚧、蚜蟲、木虱等刺吸式口器害蟲[3]。目前文獻關于螺蟲乙酯及其代謝物的研究主要有殘留物檢測方法研究、殘留消解動態研究、膳食攝入評估研究等。已報道螺蟲乙酯及其4種代謝物的檢測方法有高液相色譜法[4-5]、液相色譜-三重四極桿串聯質譜法( LC- MS)[6-7]、氣相色譜-三重四極桿串聯質譜法(GC-MS)[8]等。主要涉及作物為山楂[9]、枸杞[10]、龍眼[11]、柑橘[12]、獼猴桃[13]、梨[14]、番茄[15-17]、紫茄子[18]、莧菜[19]、豌豆[20]等。殘留消解研究有土壤[21]、棉花[22]、辣椒[23]、大豆[24]等。膳食攝入評估研究有莢豌豆和豌豆[25]、甜椒[26]、常見水果[27]等。趙靜等[28]研究了利用單克隆抗體結合酶聯免疫法快速檢測螺蟲乙酯殘留的方法。關于柿子中螺蟲乙酯殘留的檢測方法尚未見報道，國家標準中也尚未確定其檢測方法。本文在優化QuEChERS 前處理的基礎上，建立高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀器檢測方法，對柿子中螺蟲乙酯及其代謝物進行了同時測定，為檢測柿子中的螺蟲乙酯及其代謝物的方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設備 儀器：LC-30AD高效液相色譜儀；LCMS-805質譜儀；L-550型臺式低速大容量離心機；KQ-5200DB型超聲波數控清洗儀；VX-III-Multi-Tube Vortexer；FP-3010食品加工機；SQP系列和BSA224S型電子天平。

1.2 試劑和材料 螺蟲乙酯標準品純度98.5%；螺蟲乙酯-烯醇-葡萄糖苷標準品純度94.8%；螺蟲乙酯-酮醇-羥基94%；螺蟲乙酯-烯醇標準品純度99.1%；螺蟲乙酯-單-羥基標準品純度99.7%。乙腈(色譜純)；甲酸(色譜純)；甲醇(色譜純)；氯化鈉(分析純)；GCB凈化劑(石墨化碳黑)；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠凈化劑(PSA)。供試柿子品種為“陽豐”，采自河南省農科院現代研究開發基地1號百果園內。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗樣品的采集、制備 將田間采集的柿子樣本放入帶有干冰的泡沫箱中運至實驗室，加干冰粉碎后，冷凍保存待測。

1.3.2 樣品前處理 稱取粉碎后的10g樣品放入100mL離心管，加入20mL乙腈和2.5g氯化鈉，將離心管置于多管渦旋振蕩器中渦旋提取10min后，放入離心機，4 000r/min下離心5min，取2mL上清液至裝有GCB和PSA(含量0.02g和0.05g)混合凈化材料的2mL離心管中，再次渦旋震蕩1min后，4 000r/min離心條件下離心5min，過0.22μm針孔濾膜，待液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀測定。

1.3.3 標準溶液配制 稱取適量的螺蟲乙酯、S1、S2、S3、S4標準品，經乙腈溶解定容成1 000mg/L的母液，用柿子空白基質配制標準溶液，濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L。

1.3.4 高效液相色譜條件 色譜柱：Shim-pack GISS(1.9μm，50mm×2.1mm)；柱溫：40 ℃；流速：0.3mL/min；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫條件(表1)。

表1 液相色譜流動相梯度洗脫條件

1.3.5 質譜條件 電離方式：ESI+(電噴霧離子源正離子)；碰撞誘導解離氣(CID)：270 kpa；霧化氣流量：3.0L/min；加熱氣流量：10L/min；接口溫度：300℃；DL溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；檢測方式：多重反應監測(MRM)，質譜參數(表2)。

表2 MRM模式下螺蟲乙酯及其代謝物質譜參數

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇 甲醇、乙醇、乙酸乙酯等提取溶劑與水相溶，螺蟲乙酯代謝產物在樣品基質中極性較強不能被完全提取出來，乙腈易購買，用量少，有利于節約成本、減少試驗廢棄物對環境的污染，且乙腈作為提取溶劑時回收率為71%～97%，符合《農作物中農藥殘留試驗準則》(NY/T 788-2018)的要求，最終選用乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化材料選擇 常用凈化材料有PSA、C18和 GCB，其中PSA有效成分是其表面鍵合的氨基，對于樣品中脂肪酸、有機酸、糖類、部分親脂性色素具有較強的吸附作用，對水溶性色素的吸附作用較差；C18可以直接吸附去除樣品中所含脂肪等非極性化合物；GCB對色素、類胡蘿卜素等有較強的吸附凈化能力。由于柿子中糖類、有機酸類、胡蘿卜素含量較多，參考螺蟲乙酯及其代謝物在枸杞[10]和甜椒[26]中殘留檢測時所使用的凈化材料及用量，因此凈化材料選擇PSA和GCB，用量分別為0.05g和0.02g。

2.3 標準曲線 選取柿子空白基質溶液，按1.3.3配制標準液，在1.3.4高效液相色譜條件和1.3.5質譜條件下，以峰面積(A)-濃度(mg/L)作標準曲線(表3)，在0.005～0.500mg/L范圍內，螺蟲乙酯及其代謝產物S1、S2、S3、S4的絕對系數R2范圍為0.991 4～0.999 7，均>0.99，呈現良好的線性關系。羊河等[9]報道螺蟲乙酯及其代謝物S1和S3在山楂中的基質效應ME值分別為-29%、73%和24%，|ME|>20%，基質效應較強；S2和S4的基質效應ME值分別為-11%、6%，|ME|<20%，基質效應弱。為建立螺蟲乙酯及其代謝物統一的前處理及儀器方法，減少基質效應對螺蟲乙酯及代謝物S1和S3的影響，增加檢測結果的可比性，本試驗使用基質標準曲線進行定量。

表3 螺蟲乙酯及其代謝物標準曲線和絕對系數

2.4 添加回收率與相對標準偏差 在柿子的空白對照樣品中分別添加不同濃度的螺蟲乙酯、S1、S2、S3、S4標準溶液，搖勻后靜置30min，按照1.3.4中樣品提取方法處理，添加回收率(表4)。在0.01、0.1、10mg/kg的添加水平下，柿子中螺蟲乙酯的平均回收率為96%～104%，相對標準偏差為1.7%～2.6%；螺蟲乙酯代謝物S1、S2、S3、S4的平均回收率分別為93%～103%、98%～102%、98%～102%、99%～101%，相對標準偏差分別為1.6%～3.4%、1.8%～4.7%、2.0%～4.5%、0.8%～3.3%。平均回收率和相對標準偏差均符合NY/T 788—2018[29]的規定。柿子空白樣品色譜圖(圖1)，螺蟲乙酯及其代謝物3個添加濃度的色譜圖(圖2～4)螺蟲乙酯及其代謝物在優化后的該方法下，取得較好的分離效果，能夠實現預期檢測要求。

表4 柿子中螺蟲乙酯及其代謝物添加回收率試驗結果(n=5)

圖1 柿子空白樣品色譜圖

圖2 添加濃度為0.01mg/kg色譜圖

圖3 添加濃度為0.1mg/kg色譜圖

圖4 添加濃度為10mg/kg色譜圖

2.5 最小最低檢出濃度和檢出量 螺蟲乙酯及其4個代謝物的最低濃度均為0.01mg/kg；螺蟲乙酯和S3的最小檢出量均為5×10-13g，S1和S2最小檢出量均為2×10-12g，S4最小檢出量為1×10-12g。

3 結論

本試驗建立了同時測定柿子中螺蟲乙酯及其代謝產物的殘留檢測方法，優化了基于QuEChERS樣品前處理下的高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜法，柿子中螺蟲乙酯及其4個代謝物的回收率為93%～104%，RSD為0.8%～4.7%，檢測方法滿足《農作物中農藥殘留試驗準則》的要求。該檢測方法操作便捷、檢測分析用時短、反應靈敏度高，適用于柿子中螺蟲乙酯及其代謝產物殘留的測定。