中藥及提取物抗潰瘍性結腸炎腸上皮細胞凋亡作用機制研究進展

陳婷 肖慧榮 蔡弘 肖亞婧

（1江西中醫藥大學2020級碩士研究生 南昌 330004；2江西中醫藥大學附屬醫院 南昌 330006）

潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis,UC）是一種全球性、難治性炎癥性腸道疾病。UC的確切病因尚不明確，但隨著研究的深入，人們已經充分認識到其發病是由異常免疫反應介導，其特征是免疫細胞的強大激活、炎癥級聯和黏附分子的產生，造成腸道上皮受損及功能紊亂[1]。近來眾多研究表明，腸道上皮細胞（Intestinal Epithelial Cells,IEC）的異常凋亡在UC發病中有著重要作用。IEC過度凋亡使腸上皮通透性增高、黏膜屏障損傷，繼而在多因素作用下激發過度的免疫應答，最終引起失控的炎癥反應和黏膜的持續性損傷[2]。因此，有效抑制IEC過度凋亡對UC的臨床治療具有關鍵意義。本文就中藥及提取物抗腸上皮細胞凋亡的途徑進行綜述，以期闡明其抗腸上皮細胞凋亡的作用機制，同時希望啟發新的治療策略。現報道如下：

1 腸上皮細胞凋亡與UC關系

腸上皮屏障是一個由緊密連接的上皮細胞組成的虛擬壁，分泌黏液、蛋白酶、激素和免疫介質，它限制了微生物組和免疫系統之間的相互作用，在抵御腸道異常免疫應答中起著重要作用[3]。IEC不僅控制消化過程，而且形成一個物理屏障來保護宿主。位于營養物質和復雜的微生物生態系統的界面上，IEC有效阻擋了腔內抗原的吸收及黏膜微生物的入侵，對維持腸黏膜屏障功能穩定性至關重要[4]。腸道黏膜結構是由上皮細胞的增殖和凋亡這兩者間的生理平衡來維持的。在應對微生物入侵時，IEC發生死亡以維持腸上皮功能，并保持持續更新和組織穩態。當這個生理平衡被打破時，細胞凋亡的速度遠快于代償性增殖，就會導致緊密連接上皮層的缺失，破壞腸道黏膜屏障[5]。此時，腸腔內各類抗原將過度暴露于黏膜固有層，通過激活相關炎癥細胞通路，增加促炎因子釋放，產生級聯炎癥反應和持續性黏膜損傷[3]。

2 腸上皮細胞凋亡途徑及中藥和提取物的干預作用

2.1 死亡受體介導途徑 死亡受體通路是細胞凋亡的外在途徑。死亡受體（Death Receptor,DR）是一類細胞表面表達的Ⅰ型跨膜受體，構成了腫瘤壞死因子受體超家族的一部分，對于免疫調節、細胞增殖、凋亡和形態發生等至關重要[6]。這類受體包括腫瘤 壞 死 因 子 受 體1（TNFR1）、CD95（又 稱Fas/APO-1）、腫瘤壞死因子（TNF）相關的細胞凋亡誘導配體（TRAIL）-R1（又稱DR4）、TRAIL-R2（又稱DR5/APO-2）以及DR3（TRAMP）等[7]。死亡受體-配體系統誘導細胞的程序性死亡-細胞凋亡。同源受配體結合可以招募Fas相關死亡結構域蛋白（FADD）、腫瘤壞死因子受體相關死亡結構域蛋白（TRADD），形成復雜的死亡誘導信號復合物，進而作用于下游效應分子-半胱天冬氨酸蛋白酶家族中的Caspase-8，通過活化的Caspase-8啟動關鍵的細胞凋亡執行者Caspase-3，酶解結構蛋白并裂解DNA相關修復分子等，導致DNA片段切割和凋亡小體形成這一凋亡反應級聯[8]。主要通過TNF-TNFR1、Fas-FasL和TRAIL-TRAILR1/2這3條信號途徑介導細胞凋亡。其中Fas-FasL介導途徑與腸上皮細胞凋亡密切相關，且UC黏膜Fas及FasL的高表達與疾病活動性成正相關[9]。

大量研究證實中藥及中藥的提取物能有效阻斷Fas-FasL途徑誘導的IEC過度凋亡，改善腸黏膜潰瘍和炎癥損傷，可能通過下調FADD、Fas-FasL和Caspase-3來實現。雷公藤的有效成分雷公藤多苷是具有抗炎、抗免疫的天然提取物。楊強等[9]通過Real-time PCR檢測Fas/FasL，證實雷公藤多苷能抑制UC大鼠結腸黏膜的Fas、FasL蛋白表達，同時調控p38 MAPK信號通路，通過抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等致炎因子釋放，改善UC炎癥和黏膜損傷。閆曙光等[10]研究表明烏梅丸方通過降低結腸上皮Fas、FasL mRNA以及Caspase-3的表達來抑制IEC過度凋亡。曹思齊等[11]研究發現芍藥湯對濕熱型UC大鼠結腸黏膜表達FADD、Caspase-8 mRNA及蛋白有明顯抑制作用，可延緩IEC的凋亡。

2.2 線粒體介導途徑 線粒體介導途徑是內在凋亡通路。線粒體的功能和代謝決定和調節IEC特性，如分化狀態、增殖和凋亡。不同刺激引起線粒體膜電位降低，致使膜通透性增加。線粒體膜通透性增加引起細胞質內細胞色素C（Cytochrome C,Cyt-C）的釋放，是該途徑中的一個關鍵環節。Cyt-C通過與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結合，并利用ATP/dATP介導的前體蛋白Procaspase-9誘導形成Caspase-9，隨后啟動劊子手Caspase-3引起細胞凋亡[12]。線粒體跨膜電位的改變由線粒體膜上的復合通道-線粒體通透性轉變孔（MPTP）的開放和作用于線粒體膜磷脂的B細胞淋巴瘤（Bcl）-2基因家族調控線粒體膜通透性決定。具體體現在兩方面：一是MPTP持續開放導致的跨膜電位消失；二是Bcl-2家族抗凋亡和促凋亡蛋白之間的平衡失調，使得線粒體膜通透性升高，跨膜電位降低。Bcl-2家族促凋亡蛋白，包括Bid、Bax、Bak、Bad、Bim，作用于線粒體膜增加其通透性，抗凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-xL則拮抗促凋亡蛋白，起到穩定線粒體膜作用[13]。另外，有研究顯示線粒體自噬可清除線粒體損傷帶來的黏膜傷害。線粒體損傷后，活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）被釋放，過量的ROS激活炎性小體NLRP3，進一步刺激促炎因子IL-1β、白細胞介素-18（IL-18）分泌并發生由Caspase-1誘導的細胞凋亡[14]。線粒體自噬途徑則可清除發生功能障礙的線粒體，調控NLRP3介導的炎性反應和上皮損傷，其主要通過PINK1-Parkin、BNIP3-NIX和FUNDC1介導的經典信號通路實現[15]。

丹參醇是來源于中藥丹參的一種天然產物，研究證實其可明顯降低Bax及Caspase-3、Caspase-9在大腸黏膜系的表達，同時降低促炎因子白細胞介素-6（IL-6）、TNF-α等的濃度，減輕IEC凋亡和炎癥反應[16]。中藥復方左金丸通過上調Bcl-2、下調Bax和Caspase-3蛋白表達抑制腸上皮的過度凋亡，并調節輔助性T細胞與調節性T細胞的平衡，進一步減輕炎癥反應和黏膜損傷[17]。此外，中藥調控線粒體自噬途徑治療UC也取得不錯療效。劉宇等[18]研究發現彝藥翻白草可提高急性UC小鼠線粒體自噬基因轉錄因子核因子（Nuclear Factor-kappa B,NF-κB）、p62、parkin的表達，促進IEC線粒體自噬途徑及下調炎性細胞因子，從而抑制NLRP3的活化，發揮修復腸黏膜的作用。苗金雪等[19]通過動物實驗研究發現黃芩湯可調控PINK1-Parkin通路激活線粒體自噬，從而緩解腸道炎癥損害。

2.3 內質網應激介導途徑 內質網是加工和轉運蛋白質的主要細胞器。不同細胞應激狀態可導致內質網腔內蛋白質無法折疊或錯誤折疊，積累一定量后會產生內質網應激（Endoplasmic Reticulum Stress,ERS），并觸發一種適應性的保護反應-未折疊蛋白反應（Unfolded Protein Response,UPR）。UPR通過減少未折疊或錯誤折疊蛋白的積累，恢復正常的內質網功能，從而維持細胞內穩態。這一代償機制可通過上調ERS激發的標志蛋白-葡萄糖調節蛋白78（GRP78，又稱Bip）的表達，觸發下游三條信號通路-肌醇需求酶1α-X框結合蛋白1（IRE1α-XBP1）、蛋白激酶R樣內質網激酶-真核細胞翻譯起始因子2α（PERK-eIF2α）和活化轉錄因子6（ATF6）途徑來實現[20]。然而過量UPR引發劇烈的內質網應激，觸發細胞凋亡。可能通過以下途徑實現[21]：（1）PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途徑。ERS發生使PERK與GRP78分離，進入PERK-eIF2α途徑意圖減少未折疊和錯誤折疊蛋白，再通過活化轉錄因子ATF4進一步轉錄形成C/EBP同源蛋白（CHOP）調控凋亡相關通路-死亡受體通路和線粒體通路觸發細胞凋亡。（2）IRElα-TRAF2-ASK1-JNK途徑。長時間、過量的ERS活化IRE1α并與TNF受體相關因子2（TRAF2）特異性結合，激活凋亡信號調節激酶1（ASK1）使得c-Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化，繼而促進線粒體促凋亡蛋白Bax、Bid、Bim的增加以及觸發死亡受體途徑，誘導細胞凋亡。（3）Caspase-12途徑。前體蛋白Procaspase-12預先位于內質網的細胞質側，可在ERS的作用下被裂解活化成Caspase-12，進一步激活Caspase-9和Caspase-7，最后由Caspase-3執行細胞凋亡。

羅敏等[22]通過TNBS灌腸法造模UC小鼠，發現模型小鼠p-PERK蛋白及p-PERK mRNA表達明顯高于空白組，說明TNBS刺激會引發ERS誘導其高表達。而在持續給予芍藥湯灌胃14 d后發現大鼠結腸組織表達p-PERK蛋白及其mRNA降低，疾病活動指數也顯著降低，說明芍藥湯可能通過抑制ERS中由PERK介導的凋亡通路改善UC。青蒿琥酯作為一種青蒿素衍生物，可抑制ERS過度激活，通過降低GRP78、CHOP、Cleaved-Caspase-3以及上調Bcl-2/Bax來抑制IEC凋亡，具體與抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP和IRE1α-XBP1信 號 通路相關[23]。沈雁等[24]采用過氧化氫（H2O2）刺激法造模ERS小鼠，再用DSS法造模成UC小鼠，其結腸組織表達GRP78、Caspase-12和Caspase-3較正常組高，甘草酸苷干預后以上凋亡蛋白均降低，結腸上皮細胞凋亡率下降，有效緩解了黏膜炎癥損傷。綜上說明ERS介導的凋亡途徑是不錯的干預靶點。

2.4 MAPK介導途徑 絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinases,MAPK）的經典家族成員包括細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）、p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶（JNK1/2/3）和ERK5信號通路，它們在將細胞外刺激轉化為廣泛的細胞反應中發揮重要作用，如細胞增殖和分化、衰老和凋亡[25]。其導致細胞增殖還是凋亡取決于應激刺激和參與這種激活的細胞類型。在一些轉錄因子如激活蛋白1（AP-1）以及p53腫瘤抑制蛋白的作用下，應激激活的JNK和p38MAPK信號途徑均介導促凋亡過程，主要通過線粒體途徑進行凋亡級聯調控：影響Bcl-2家族蛋白在轉錄和/或轉錄后水平，繼而級聯激活Caspase家族引起細胞凋亡[26]。ERK1/2通路則可以通過轉錄和翻譯后機制調控Bcl-2家族蛋白來實現抗凋亡，但也有報道其有促凋亡作用。

MAPK途徑介導的細胞凋亡是一個治療UC的潛在靶點，其中p38MAPK受到廣泛研究。蒲公英甾醇是從蒲公英根提取的一種植物甾醇。車璐[27]通過實驗證實其可通過抑制p38MAPK信號通路有效抑制結腸上皮細胞凋亡和減輕UC炎癥反應，體現在蒲公英甾醇下調p38MAPK、Bax、Caspase-3，上調Bcl-2，并抑制NF-κB激活釋放TNF-α、IL-6等致炎因子。白頭翁皂苷B4是從白頭翁中提取的一種生物活性三萜皂苷，被證明可通過抑制p53、Caspase-3和bax的表達對IEC具有抗凋亡作用[28]。

2.5 NF-κB介導途徑NF-κB調節多種基因的轉錄和表達，在細胞增殖、分化、凋亡以及免疫、炎癥調控等方面發揮重要作用。在靜息狀態下，NF-κB通常以p50和p65形成的異二聚體形式存在，并與抑制性蛋白IκBα結合成三聚體復合物被封存在細胞質中；在多種刺激因素如IL-1β、TNF-α、氧自由基及脂多糖等抗原的作用下，IκBα被IKK復合物催化發生磷酸化而解離，使得NF-κB異位至細胞核內激活轉錄。隨后NF-κB轉錄表達各凋亡蛋白基因，調節由外在和內在途徑介導的細胞凋亡[29]。此外，活化的NF-κB再度激活致炎因子TNF-α、ILs，并通過正反饋使NF-κB活化釋放更多炎癥介質，加重炎癥反應和黏膜損傷。

IKK/IKB/NF-κB通路是NF-κB活化的經典信號通路。相關研究表明黃芩苷通過調節IKK/IKB/NF-κB對TNBS誘導的UC大鼠具有顯著的抗凋亡作用，與下調Cyt-C、Caspase-3、Caspase-9和Bax等凋亡蛋白表達相關[30]。山藥皮提取物6,7-二羥基-2,4-二甲氧基菲可通過抑制ERK1/2、NF-κB p65、pNF-κB、COX-2蛋白表達，顯著下調Caspase-3和凋亡率，并可降低結腸致炎因子的產生，顯著改善DSS誘導的結腸黏膜損傷[31]。黃連素是黃連的有效活性成分之一，研究證實其可通過抑制IEC凋亡和炎癥反應來維持腸上皮屏障的完整性，表現在抑制IκBα的磷酸化及NF-κB p65的核異位，下調Bax、Caspase-3、TNF-α等致炎因子和上調Bcl-2，明顯緩解腸上皮細胞的凋亡，改善黏膜屏障功能[32]。

2.6 PI3K-Akt信號途徑 蛋白激酶B（Protein Kinase B,PKB/Akt）是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，由磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol-3-Kinases,PI3K）激活和調控，PI3K-Akt信號通路通過磷酸化調控叉頭框O轉錄因子（FoxO），調節細胞增殖和存活[33]。FoxO已經成為PI3K/Akt調控細胞凋亡的一個重要效應臂，通過驅動多個凋亡基因表達的信號傳導：（1）FoxO通過增強FasL和TRAIL等促凋亡因子的轉錄，直接調控外在凋亡通路；（2）FoxO可以上調Bad、Bim、BNIP3，抑制Bcl-xL，通過內在凋亡途徑誘導細胞死亡。

黃芩苷抑菌抗炎活性顯著，朱磊等[34]研究發現其可通過PI3K-Akt途徑抑制結腸組織COX-2、Caspase-9、FasL等蛋白的表達，從而緩解上皮細胞凋亡。木香根被證實是天然抗炎劑，以其為原料的木香根顆粒可抑制UC大鼠的炎癥反應和結腸上皮細胞凋亡，潛在機制分析表明可能與其調控PI3K/Akt信號通路相關[35]。因此，通過調控PI3K-Akt信號通路抑制FoxO的表達對防止IEC過度凋亡有著重要作用。

2.7 其他相關途徑 除上述介紹的途徑之外，還有一些其他報道的途徑與抗IEC凋亡相關。如Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子3（JAK/STAT3）信號通路，具有信號轉導和調控轉錄的作用，同樣調控著細胞凋亡。步楠等[36]研究發現雷公藤多苷可通過抑制JAK2/STAT3信號通路上調大鼠結腸組織Bcl-2、Bcl-xL、下調Caspase-9和Caspase-3以及炎癥因子的表達，表現出顯著的抗IEC凋亡作用。此外，藏紅花素可通過上調Bcl-2/Bax，下調Caspase-3來緩解結腸細胞凋亡，其潛在作用機制與抑制TLR4/MYD88信號通路的激活相關[37]。

3 小結與展望

腸上皮細胞異常凋亡破壞黏膜屏障的完整性，削弱了腸道的防御功能，是UC發病發展過程中的關鍵環節。其中死亡受體（外在）和線粒體（內在）介導途徑是關鍵，其他途徑通過各種信號通路影響，介導外在和/或內在凋亡途徑引起IEC凋亡。中藥及提取物可通過多途徑起到良好的抗IEC凋亡作用。在UC期間，抑制炎癥介質釋放和維持腸道黏膜屏障的完整性是現有藥物的主要靶點之一。由于已知的不良反應和不斷上升的藥物治療成本，植物性抗炎劑在腸道炎癥性疾病中逐漸受到重視。安全有效的中藥及其提取物的開發利用無疑是治療UC的一種有吸引力的替代方法。未來研究可從以下幾方面深入：（1）中藥及提取物抗細胞凋亡作用機理尚不明確，缺乏大量的臨床試驗，藥理學層面的研究尚需深入探討；（2）有些途徑如MAPK介導途徑對細胞凋亡有雙重調控作用-促進或抑制，這仍需大量試驗研究明確個中機制；（3）某些藥物如黃芩苷可通過多途徑調節腸上皮細胞凋亡，其與UC核心靶點網絡的潛在相互作用及串擾值得進一步探索。