重組生長激素預處理對卵巢低反應患者促排卵結局及子宮內膜容受性的影響

楊元菁，施曉鋆*，王聰

(1.貴州醫科大學，貴陽 550004；2.貴陽市婦幼保健院，貴陽 550003)

有研究數據表明，2007—2020年間，我國不孕癥發病率已上升至18%[1]。且隨著“二胎政策”及“三胎政策”的調整，符合生育政策的女性中高齡婦女占比越來越多。一項調查報告顯示在1 674名年齡≥35歲的女性中，有生育意愿的占78.43%[2]。年齡是卵巢低反應(poor ovarian response，POR)發病的第一相關因素，POR在不孕患者中的發病率逐漸升高。隨著社會經濟發展、不良生活習慣增加等因素，許多年輕的不孕患者也出現POR。輔助生殖助孕治療中，許多POR患者在調整了促排卵方案后，仍表現為Gn用量大、獲卵數少、周期取消率高，不能獲得理想的促排卵結局，加重了患者的經濟和精神壓力，也給臨床工作者帶來了難題。重組生長激素(r-GH)除了用于治療發育障礙及燒傷外，近年來的研究發現其對生殖系統也有一定的作用，主要可從胚胎和子宮內膜容受性兩方面來影響助孕結局[3-4]。通過促排卵治療可獲得一定數量的卵子，經過體外受精后獲得胚胎。促排卵結局可通過獲卵數、MⅡ卵數及優質胚胎率等數據來評價。同源框基因A10(homeboxA10gene，HOXA10)在著床種植窗口期呈表達高峰，與子宮內膜容受性及胚胎著床過程有一定相關性[5]，可作為評價子宮內膜容受性的可靠指標之一。目前關于r-GH應用于POR患者的臨床效果仍存在爭議。本研究通過對照實驗觀察r-GH對POR患者促排卵結局及子宮內膜容受性的改善情況，以期為臨床治療提供一定的參考。

資料與方法

一、研究對象及分組

選取2020年10月至2021年12月就診于貴陽市婦幼保健院生殖中心的75例POR患者為研究對象。納入標準：(1)符合博洛尼亞POR診斷標準[3]；(2)年齡小于38歲；(3)體質量指數(BMI)范圍18.0～29.0 kg/m2；(4)上一周期促排卵方案采用高孕激素狀態下促排卵(PPOS)方案；(5)月經周期規律；(6)采用IVF授精方式。排除標準：(1)存在腦垂體疾病或內分泌疾病(如甲亢、甲減、糖尿病、高泌乳素血癥等)；(2)同時采用了其他改善卵巢儲備功能的措施，包括口服脫氫表雄酮、服用中藥、進行針灸等；(3)合并多囊卵巢綜合征、子宮內膜異位癥、輸卵管積水、子宮內膜息肉、宮腔粘連、粘膜下肌瘤等；(4)GH使用禁忌者；(5)夫婦雙方至少一方核型異常；(6)男方存在少、弱、畸形精子癥或無精子癥等。

將符合上述標準的75名受試者按1∶2的比例隨機分為對照組(不給予r-GH預處理，25例)和預處理組(給予r-GH預處理，50例)；兩組患者均只納入首個促排卵周期的臨床資料。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有入組患者均簽署知情同意書。

POR的診斷：根據博洛尼亞標準[6]，符合以下3條中的兩條即可診斷為POR：(1)大于或等于40歲或存在任何其他高危因素；(2)之前因卵巢反應不良取消周期，或獲卵數小于3個；(3)卵巢儲備功能異常：抗苗勒管激素(AMH)<1.1 ng/ml或基礎竇卵泡計數(AFC)<5～7個。

二、r-GH預處理及促排卵

預處理組患者在月經周期第9～10天行B超檢查監測排卵，排卵后7～9 d在子宮內膜種植窗口期予r-GH注射液(賽增，15 U/支，長春金賽藥業)2 U/d肌肉注射，使用4～6周，直至第2次月經周期第2～3天啟動PPOS方案，并在啟動日將r-GH劑量增加至4 U/d直至扳機日。本周期仍然采用PPOS方案促排卵，具體操作為：口服醋酸甲羥孕酮(安宮黃體酮，2 mg/片，浙江仙琚制藥)8～10 mg/d，予注射用尿促卵泡素(麗申寶，75 U/支，珠海麗珠制藥)225～300 U/d肌肉注射。當≥1個卵泡直徑>20 mm或者≥3個卵泡直徑>18 mm時，皮下注射醋酸曲普瑞林注射液(1 ml∶0.1 mg，長春金賽藥業)1 ml及肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(HCG，2 000 U/支，珠海麗珠制藥)2 000 U雙扳機。

對照組患者不予r-GH預處理，直接啟動PPOS方案。

扳機后34～36 h在陰道超聲引導下取卵。取卵后4～6 h行常規IVF，受精卵培養至第3天或第6天將卵裂期胚胎或囊胚采用快速冷凍法保存于液氮中備用。

三、子宮內膜組織中HOXA10表達檢測

1.主要試劑及儀器：蘇木素染液(LM10N13，北京百靈威科技有限公司)、DAB試劑盒(ZLI-9018，北京中杉金橋生物有限公司)、山羊血清(SP9001，北京中杉金橋生物有限公司)、兔多克隆一抗HOXA10(Bs-2502R，北京博奧生物技術有限公司)、山羊抗兔二抗(SP9001，北京中杉金橋生物有限公司)、Ultrapure RNA Kit(CW0581M，50250，北京康為世紀公司)，HiScript Ⅱ One Step qRT-PCR SYBR Green Kit(Q221-01，7E220E8，南京Vazyme生物科技股份有限公司)、包埋機(BMJ-Ⅲ，常州中威電子儀器廠)、實時熒光PCR儀(QuantStudio1，AppliedBiosystems公司，美國)、低溫離心機(C2500，湖南湘儀實驗儀器廠)，一次性使用S型宮腔組織吸引管(立可靈，TY-C3.1/3-1S，上海家寶醫學保健科技有限公司)。

2.樣本采集：預處理組中有10名患者自愿接受子宮內膜容受性檢測并簽署知情同意書。在使用r-GH預處理前的子宮內膜種植窗口期，通過一次性使用S型宮腔組織吸引管采集子宮內膜組織，r-GH預處理4～6周后，下一個月經周期的子宮內膜種植窗口期再次留取子宮內膜組織(操作同前)。將子宮內膜樣本分為2份，各約2 g，分別進行福爾馬林固定及0～2℃冷藏保存。

3.子宮內膜組織HE染色：福爾馬林固定組織后經全自動脫水機脫水，石蠟包埋后制作切片(厚度5 μm)，放置45℃恒溫箱中烘干。蘇木素染色5 min，自來水沖洗，1%鹽酸乙醇分化30 s，充分水洗，返藍；伊紅染色2 min，自來水沖洗，脫水封片。在顯微鏡下觀察并進行圖像采集。

“我們不是一個人在戰斗！”省林科院副研究員陳景震幽默地說。他定點服務的是宜章縣白石渡鎮。那里，已經建起近兩千畝板栗林，陳景震此行的目的是針對板栗林產量下降和落果的問題進行診斷，通過改良和科學種植，屆時，板栗林的畝產有望從目前的60公斤提高到200公斤。

4.免疫組化法檢測HOXA10蛋白表達：切片制作同HE染色。使用3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶，血清封閉，滴加一抗后4℃過夜，PBS沖洗5 min×3次；滴加二抗后37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次；DAB顯色，復染細胞核后，脫水封片。使用三目顯微攝像系統(BA400Digital，廈門麥克奧迪實業集團有限公司)進行圖像采集，以細胞膜或細胞質中出現棕黃色或黃色顆粒為HOXA10表達陽性；使用Halo數據分析系統(Indica labs，美國)計算每張圖像中的陽性面積占比(陽性面積/總面積×100%)。

5.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測HOXA10 mRNA表達：將冷藏保存的子宮內膜標本加入液氮研磨，提取總RNA，鑒定后逆轉錄為cDNA，進行qRT-PCR擴增反應。引物由生工生物工程公司(上海)設計并合成，HOXA10基因的上游引物：5′-GGCAAAGAGTGGTCGGAAGA-3′，下游引物：5′-GTGGACGCTGCGGCTAAT-3′；GADPH上游引物：5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′，下游引物：5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′。PCR反應條件：55℃ 5 min，95℃ 5 min預變性，95℃ 10 s變性，60℃ 30 s退火；重復45個循環。使用Thermo Scientific PikoReal軟件分析各樣本的CT值，通過2-ΔΔCT公式計算HOXA10相對mRNA表達水平(其中CT為循環閾值)。

四、觀察指標

比較兩組患者的一般資料(年齡、不孕年限、基礎性激素水平等)、促排卵實驗室指標(Gn總量和天數、AFC、HCG日內膜厚度、獲卵數等)、胚胎發育指標(2PN率、優質胚胎率)，以及HE染色的鏡下特點、HOXA10在mRNA和蛋白水平的表達。其中2PN率=正常受精卵母細胞數/獲卵數×100%，優質胚胎率=優質胚胎數/正常受精卵母細胞數×100%。

五、統計學分析

結 果

一、兩組患者一般資料比較

對照組和預處理組患者的年齡、不孕年限、BMI、AMH、基礎FSH(bFSH)、基礎LH(bLH)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般資料比較(-±s)

二、兩組患者促排卵及胚胎發育指標比較

兩組患者Gn天數、AFC、HCG日E2及內膜厚度、2PN率及優質胚胎率比較均無顯著性差異(P>0.05)；預處理組患者Gn總量顯著低于對照組，獲卵數及MⅡ卵數顯著高于對照組(P均<0.05)(表2)。

表2 兩組患者促排卵及胚胎發育指標比較[(-±s)，%]

三、預處理組患者r-GH預處理前后自身對照比較

比較預處理組患者本周期(給予r-GH預處理)與上一周期(未予r-GH預處理)促排卵及胚胎發育的相關指標，結果顯示本周期的Gn總量、Gn天數顯著低于上一周期(P<0.05)，獲卵數、MⅡ卵數及優質胚胎率顯著高于上一周期(P均<0.05)(表3)。

表3 預處理組患者r-GH預處理前后自身對照比較[(-±s)，%]

四、不同年齡POR患者中r-GH預處理與否的相關指標比較

按照年齡不同將所有入組患者分為<35歲組(41例)和≥35歲組(34例)進行比較，分析年齡對r-GH預處理的影響。

1.<35歲組中對照組和預處理組相關指標比較：<35歲組中對照組和預處理組的一般情況均無顯著性差異(P>0.05)(表4)。兩組的Gn總量、Gn天數、AFC、HCG日E2、HCG日內膜厚度、獲卵數、MⅡ卵數及2PN率、優質胚胎率比較均無顯著性差異(P均>0.05)(表5)。而在預處理組自身對照數據中，行r-GH預處理的本周期中Gn天數顯著低于上一周期，獲卵數及MⅡ卵數顯著高于上一周期(P均<0.05)(表6)。

表4 <35歲患者中對照組和預處理組一般情況比較(-±s)

表5 <35歲患者中對照組和預處理組促排卵及胚胎發育指標比較[(-±s)，%]

表6 <35歲患者預處理組r-GH預處理前后自身對照比較[(-±s)，%]

2.≥35歲組中對照組和預處理組相關指標比較：≥35歲組中對照組和預處理組的一般情況均無顯著性差異(P>0.05)(表7)。預處理組的Gn天數顯著低于對照組，優質胚胎率顯著高于對照組(P<0.05)，其余促排卵指標均無顯著性差異(P>0.05)(表8)。而在預處理組自身對照數據中，本周期的Gn天數顯著低于上一周期，獲卵數、MⅡ卵數及優質胚胎率顯著高于上一周期(P均<0.05)(表9)。

表7 ≥35歲患者中對照組和預處理組一般情況比較(-±s)

表8 ≥35歲患者中對照組和預處理組促排卵及胚胎發育指標比較[(-±s)，%]

表9 ≥35歲患者預處理組r-GH預處理前后自身對照比較[(-±s)，%]

五、子宮內膜組織r-GH預處理前后HE染色鏡下特點比較

由子宮內膜組織功能層HE染色結果(圖1)可見，給予r-GH預處理前后均可見子宮內膜組織腺上皮細胞開始出現頂漿分泌，腺腔不規則，間質疏松水腫，螺旋小動脈增生，符合子宮內膜分泌中期特點。

A：r-GH預處理前內膜組織；B：r-GH預處理后內膜組織。鏡下特點均符合子宮內膜分泌中期特點：紅色箭頭示腺上皮，綠色箭頭示腺管腔，黃色箭頭示血管腔，藍色箭頭示間質。圖1 子宮內膜組織HE染色(×100)

六、r-GH預處理前后HOXA10表達情況

1.免疫組化法檢測HOXA10蛋白表達情況：r-GH預處理前后子宮內膜腺上皮細胞質內及細胞間質均可見HOXA10蛋白棕黃色或黃色陽性表達，提高放大倍數后肉眼可見r-GH預處理后HOXA10蛋白陽性表達較多(圖2)；使用Halo數據分析系統計算每張圖像的陽性面積占比，結果顯示使用r-GH預處理后的子宮內膜中HOXA10蛋白表達陽性面積占比顯著高于預處理前(P<0.05)(表10)。

A：r-GH預處理前內膜組織(×100)；B：r-GH預處理后內膜組織(×100)；C：r-GH預處理前內膜組織(×400)；D：r-GH預處理后內膜組織(×400)。鏡下可見子宮內膜腺上皮細胞質內及細胞間質HOXA10蛋白陽性表達；黑色箭頭示蘇木素染色為藍色的細胞核，紅色箭頭示棕黃色或黃色的HOXA10蛋白表達。圖2 免疫組化法檢測子宮內膜腺上皮細胞HOXA10蛋白表達情況

2.qRT-PCR檢測HOXA10 mRNA表達情況：qRT-PCR溶解曲線顯示HOXA10及內參GAPDH均可特異性擴增，擴增曲線顯示r-GH預處理后的目標基因表達曲線率先升高并達到平臺期(圖3、4)。計算mRNA相對表達量后進行統計分析發現，r-GH預處理后子宮內膜中HOXA10 mRNA表達量顯著高于預處理前(P<0.05)(表10)。

圖3 GAPDH溶解曲線及擴增曲線

圖4 HOXA10溶解曲線及擴增曲線

表10 免疫組化和qRT-PCR檢測r-GH預處理前后HOXA10表達情況(-±s)

討 論

目前國內外文獻報道的POR發病率為5.6%～35.1%[7]，其具體病因并不明確，多認為與年齡、免疫因素、遺傳因素、卵巢手術、環境因素及放化療等有關，其中年齡為主要因素。隨著年齡增長竇卵泡逐漸消耗，卵巢儲備能力顯著下降[8]，表現為AMH降低、基礎FSH升高、AFC減少及獲卵數減少等；另一方面隨著氧自由基的堆積，卵子質量也逐漸下降，促排卵周期中可表現為MⅡ卵數少、2PN率低、優質胚胎率低等。輔助生殖助孕治療的結局主要跟“種子”及“土壤”兩大因素相關，即胚胎質量和子宮內膜容受性。對于上一促排周期發生POR和促排卵前評估為POR的患者，進入促排卵周期前通常采用一些輔助治療方法，如應用脫氫表雄酮、輔酶Q10及GH等。GH可以改善卵子和胚胎質量以及子宮內膜容受性，最終改善輔助生殖結局。有meta分析表示GH可提高POR患者的獲卵數、MⅡ卵數及可移植胚胎數，減少Gn使用總量及使用時間，改善助孕結局[9]。本研究結論與之類似，我們在Gn啟動日前約6周(從自然月經周期分泌中期到第2次月經周期開始啟動促排方案)開始使用r-GH，這是小竇卵泡發育的階段，也是線粒體增殖、顆粒細胞發育的啟動及竇卵泡對激素敏感的階段，在這個時期應用r-GH預處理有助于始基卵泡的激活與招募，提高卵母細胞發育能力；本研究中預處理組患者的獲卵數、MⅡ卵數及優質胚胎率較對照組均顯著增加(P<0.05)。生理過程中，竇狀卵泡在月經周期第1～4天完成募集，因此我們在啟動日添加r-GH的目的在于提高卵巢對Gn的反應性，本研究結果顯示預處理組的Gn總量和Gn天數較對照組顯著減少(P<0.05)。還有研究報道在促排卵前給予GH 2 U/d預處理6周能使胚胎質量得到明顯改善[10]，我們的結論與之相似。但是也有研究提出了不同觀點，2020年發表的兩項meta分析提示GH對胚胎質量并無明顯改善[11-12]。

GH的分泌量隨著年齡的增加逐漸減少，35歲開始血清中GH水平明顯下降，40歲之后下降更為顯著[13]。因此，我們得到實驗數據后又將所有入組患者按照年齡進行分組，比較各觀察指標的差異，結果發現年齡≥35歲的POR患者中預處理組部分促排卵指標明顯改善(Gn天數顯著降低，優質胚胎率顯著增高)，而<35歲患者中預處理組促排卵結局改善并不明顯。不同年齡患者r-GH預處理前后的自身對照比較中，<35歲患者預處理后Gn天數顯著減少，獲卵數及MⅡ卵數顯著增加；≥35歲患者預處理后除上述指標變化，優質胚胎率亦顯著升高。我們推測其原因為年齡<35歲的患者機體內自身分泌的GH較多，GH與受體的結合接近飽和，即使添加更多的外源性GH也不能被有效利用。

還有研究提出GH對助孕結局的積極作用，不僅僅是通過對卵子數量及質量的提高實現的，甚至大部分成果應歸功于對子宮內膜容受性的改善[14]。莫鳳媚等[15]對因子宮內膜薄而取消移植的患者行GH宮腔內灌注，結果表明GH可改善內膜血流，對妊娠結局有積極作用。目前除了子宮內膜厚度、容積及子宮內膜下血流狀態可評價子宮內膜容受性[16]外，內膜組織中HOXA10的表達也是評價子宮內膜容受性的可靠指標之一。HOXA10在子宮內膜中呈周期性表達，在種植窗口期出現表達高峰[13]，參與人類胚胎著床過程并發揮重要作用。本研究結果顯示r-GH預處理后子宮內膜中HOXA10蛋白及mRNA表達明顯增多，提示r-GH預處理可能對改善子宮內膜容受性有積極作用，這與之前Lan等[17]的結論相似。

但本研究仍存在一定的不足：首先，研究時長尚不充分，大部分患者因胚胎冷凍未行胚胎移植導致資料數據覆蓋不完整，待進一步收集妊娠率、流產率及活產率等數據，完善相關分析。其次，納入樣本量較少，可能存在研究結果的偏倚，后續應增大樣本量進行更深入的研究。

綜上所述，在促排卵周期前對POR患者進行r-GH預處理可提高卵巢反應性，減少Gn使用時間及用量，增加獲卵數及MⅡ卵數，提高胚胎質量，且r-GH能同時改善POR患者的子宮內膜容受性，對促排卵結局有積極作用。此外，r-GH預處理可能對年齡≥35歲的POR患者益處更大。