ROCK1蛋白通過ROS調節M1巨噬細胞的極化

吳淑娟，覃曉琳，陳嬌，楊菁

(武漢大學人民醫院生殖醫學中心 湖北省輔助生殖與胚胎發育醫學臨床研究中心，武漢 430060)

復發性流產(RSA)是指與同一性伴侶發生兩到三次連續或不連續的妊娠24周前的流產[1]，除常見的解剖、遺傳、內分泌、免疫因素及感染、血栓前狀態等病因[2]外，還有約一半的患者原因不明[3]。在這些不明原因RSA患者中，母胎界面免疫微環境失調可能是其潛在的原因之一[4]。巨噬細胞約占母胎免疫屏障細胞構成的20%[5]，大量研究表明，M1和M2巨噬細胞極化失衡與母體對胎兒的免疫耐受息息相關。M1為經典激活細胞，主要分泌促炎細胞因子；M2為交替激活細胞，表達抗炎標志物[6]。環境或自身某些因素的改變引起巨噬細胞由M2向M1轉變，這時母體炎癥因子浸潤，不利于妊娠的繼續維持[7]。所以，巨噬細胞的極化可能決定了妊娠的最終結局。

Rho相關激酶1(ROCK1)是Rho亞家族最重要的效應分子之一，通過調控肌動蛋白調控細胞的形態、極性、細胞骨架重構和細胞遷移等。有學者利用U937細胞系，研究發現巨噬細胞極化可能依賴于Rho/ROCK通路[8]。有研究表明，RhoA/ROCK通過核因子-κB(NF-κB)信號通路調節炎癥發生，從而影響糖尿病腎病的發展[9]。而ROCK1是否在M1巨噬細胞極化過程中發揮作用及其可能的作用機制尚未見報導。因此，本文主要討論ROCK1對巨噬細胞向M1極化的影響。

材料與方法

一、實驗材料

1.細胞系：巨噬細胞系THP1細胞，購自中國典型培養物保藏中心。

2.主要試劑和儀器：兔抗人ROCK1抗體(武漢三鷹)；小鼠抗人β-肌動蛋白(β-actin，上海體艾比瑪特)；RPMI-1640培養基、胎牛血清(Gibco，美國)；佛波酯(PMA，Sigma，美國)；干擾素-γ(IFN-γ)、脂多糖(LPS)(Peprotech，美國)；PerCP/Cyanine5.5標記小鼠抗人CD86抗體(Biolegend，美國)；活性氧檢測試劑盒、RIPA裂解液、HRP標記的山羊抗兔二抗、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液(上海碧云天)；RNAex Pro Reagent試劑(長沙艾科瑞)；逆轉錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒(南京諾唯贊)；ROCK1抑制劑Y27632(MCE，美國)；電泳儀、凝膠成像分析系統(BIO-RAD，美國)；qPCR儀(Roche，瑞士)；普通光學顯微鏡(Olympus，日本)。

二、研究方法

1.細胞培養、誘導及實驗分組：THP1細胞系在添加10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素(武漢賽維爾)的RPMI-1640培養基中生長，然后放置于37℃、5%CO2的孵箱中培養。將懸浮的THP1細胞接種于6孔板中，以每孔100 ng/ml終濃度的PMA誘導48 h細胞貼壁，分化為M0巨噬細胞。向M0細胞的培養基中添加IFN-γ 20 ng/ml、LPS 100 ng/ml繼續誘導48 h設為M1組；向M0細胞的培養基中添加IFN-γ 20 ng/ml、LPS 100 ng/ml、ROCK1抑制劑Y27632 1 μmol/L繼續誘導48 h設為M1+Y27632組；添加等量的PBS 48 h設為對照M0組。

2.RNA提取及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測：使用RNAex Pro Reagent試劑盒按照說明書的步驟提取巨噬細胞總RNA。用逆轉錄試劑盒在Bio-Rad PCR儀上將RNA逆轉為cDNA，cDNA稀釋6倍后，利用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR試劑在Roche RT-PCR系統上進行qRT-PCR，檢測促炎因子白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細胞趨化性蛋白1(MCP1)、CXC趨化因子配體16(CXCL16)和ROCK1的mRNA表達水平。PCR擴增條件：95℃ 60 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，共計40個循環。基因表達定量采用2-ΔΔCt法計算，選擇GAPDH作為內參基因，計算mRNA相對表達量。所用引物由武漢擎科公司合成，序列見表1。

表1 引物序列表

3.蛋白提取及Western blot檢測：使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸化蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液從巨噬細胞中提取總蛋白，冰上裂解20 min，超聲充分裂解細胞，12 000g4℃離心5 min，上清即為所提取的蛋白液。用BCA試劑盒測定蛋白濃度。隨后加入1/4體積的5×上樣緩沖液，95℃孵育10 min。取約30 μg蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳并轉移到0.45 μm PVDF膜上。然后將該膜置入無蛋白快速封閉液(上海雅酶)在室溫下孵育10 min，隨后與兔抗人ROCK1抗體(1∶1 000)或小鼠抗人β-actin抗體(1∶5 000)4℃下孵育過夜。PVDF膜用緩沖鹽水(武漢賽維爾)和0.1% Tween 20(TBST)洗滌3次，每次10 min，然后用HRP標記山羊抗兔二抗室溫搖床孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。隨后用凝膠成像分析系統掃描成像，觀察相應蛋白表達情況。

4. 流式細胞術檢測CD86的表達：將細胞用胰蛋白酶(北京biosharp)消化下來，PBS洗滌1次，1 000g離心5 min，用200 μl PBS重懸細胞沉淀，每孔加入5 μl PerCP/Cyanine5.5標記小鼠抗人CD86抗體，4℃孵育30 min。用PBS洗滌2次，300 μl PBS重懸后流式細胞儀檢測。細胞用Beckman流式細胞儀(Cytoflex LX，美國)進行收集，每個樣本約分析10 000個細胞。數據用FlowJo(Version 10.6.2)軟件進行分析。

5. 細胞活性氧(ROS)水平檢測：采用流式細胞術對細胞內ROS水平進行檢測，用無血清的培養基以1∶1 000稀釋ROS試劑盒中的DCFH-DA探針制備工作液，細胞消化離心后用工作液重懸，37℃孵育30 min，無血清培養基洗滌3次，200 μl PBS重懸后用Beckman流式細胞儀檢測。

三、統計學分析

結 果

一、THP1來源巨噬細胞向M1極化過程中細胞形態、IL-6、CXCL16和ROCK1 mRNA和蛋白表達變化

與對照M0組相比，M1組細胞伸出更多偽足(圖1A)；qRT-PCR結果顯示，與對照M0組相比，M1組細胞IL-6和CXCL16的mRNA水平顯著增加(P<0.05)(圖1B、C)，提示M1巨噬細胞極化成功；Western blot和qRT-PCR結果表明，與對照M0組相比，M1組細胞中ROCK1的蛋白和mRNA水平均顯著增加(P<0.05)(圖1D、E)，由此推測ROCK1可能與M1巨噬細胞的極化有關。

A：細胞形態圖；B：IL-6 mRNA表達水平檢測；C：CXCL16 mRNA表達水平檢測；D：ROCK1 mRNA表達水平檢測；E：ROCK1蛋白表達水平檢測；與對照M0組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 M1極化過程中巨噬細胞細胞形態、mRNA和蛋白表達變化

二、抑制ROCK1對促炎因子表達水平變化的影響

繼續檢測添加ROCK1抑制劑Y27632后各組中促炎因子表達水平的變化。qRT-PCR結果顯示，與對照M0組相比，M1組中促炎因子IL-6、TNF-α、MCP-1、CXCL16的mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；與M1組相比，M1+Y27632組IL-6、TNF-α、MCP-1、CXCL16的mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)(圖2)。以上結果表明抑制ROCK1能抑制M1巨噬細胞中促炎細胞因子的表達。

A：CXCL16 mRNA表達水平檢測；B：IL6 mRNA表達水平檢測；C：MCP 1 mRNA表達水平檢測；D：TNF-α mRNA表達水平檢測；與M1組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 抑制ROCK1對促炎因子表達水平變化的影響

三、抑制ROCK1對M1巨噬細胞表面標志物變化的影響

用流式細胞術檢測各組中M1巨噬細胞表面標志物CD86的表達，結果顯示，與對照M0組相比，M1組中CD86陽性細胞的比例顯著升高(P<0.01)；與M1組相比，M1+Y27632組CD86陽性細胞的比例顯著降低(P<0.05)(圖3)。結果提示，ROCK1與M1巨噬細胞的極化有關，抑制ROCK1能抑制M1巨噬細胞的極化。

A：細胞表面標志物CD86陽性細胞流式檢測圖；B：CD86陽性細胞比例統計圖；與M1組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 抑制ROCK1對M1巨噬細胞表面標志物變化的影響

四、抑制ROCK1后細胞內ROS水平變化

用流式細胞術檢測細胞內ROS水平，結果顯示，當向M1極化時，M1組細胞內的ROS水平較對照M0組顯著上升(P<0.01)；與M1組比較，M1+Y27632組ROS的水平顯著降低(P<0.01)(圖4)。提示ROCK1可能通過調節ROS水平參與巨噬細胞向M1的極化。

A：ROS流式細胞檢測圖；B：ROS平均熒光強度統計圖；與M1組比較，**P<0.01。圖4 抑制ROCK1后細胞內ROS的水平變化

討 論

大量研究證實，蛻膜中M1巨噬細胞減少，使得M2巨噬細胞占據主要地位，發揮抗炎作用得以維持正常妊娠[10]。而在異常妊娠和RSA中，女性的M1巨噬細胞水平顯著高于正常妊娠[11]。由于巨噬細胞在妊娠中起非常關鍵的作用，因此尋找巨噬細胞極化的分子機制，既有助于我們更充分認識RSA的發病過程，也為治療RSA尋找新靶點提供了理論依據。

ROCK1是Rho亞家族最重要的效應分子之一，主要調控細胞的形態、極性、細胞骨架重構和細胞遷移等。關于ROCK1的研究主要集中在腫瘤領域，沉默或者敲低ROCK1基因能抑制非小細胞肺癌、鼻咽癌、乳腺癌等的侵襲和轉移[12-14]。有研究報道沉默ROCK1基因能抑制巨噬細胞的NLRP3信號傳導，從而改善呼吸機誘導的小鼠肺損傷[15]。而ROCK1如何調節巨噬細胞的M1極化卻未見報道。

本實驗證實了ROCK1與THP1衍生的巨噬細胞M1極化相關。我們發現在LPS和IFN-γ所誘導的M1極化過程中，ROCK1的表達顯著升高。于是我們使用ROCK1的功能抑制劑Y27632探究ROCK1對巨噬細胞極化的調節作用。與M0巨噬細胞相比，M1巨噬細胞中的促炎因子IL-6、TNF-α、MCP1、CXCL16的mRNA表達水平均顯著升高，表面標志物CD86陽性的細胞比例也顯著增加；給予Y27632之后，IL-6、TNF-α、MCP1、CXCL16的mRNA表達水平較M1組顯著降低，CD86陽性細胞比例也顯著降低(P<0.05)，這提示抑制ROCK1之后抑制了M1巨噬細胞的極化。有研究報道，ROCK1在氯化鈷誘導的滋養層細胞衍生的微粒(MP)中表達升高，參與先兆子癇的發病；ROCK1蛋白可能參與正常妊娠的維持并與細胞的氧化應激相關[16]。同時由于ROS是激活炎性通路的重要介質，高水平的ROS通過表觀遺傳重編程促進M1巨噬細胞的極化[17]。我們檢測了3組細胞內的ROS水平，激活的M1巨噬細胞表達高水平的ROS，抑制ROCK1之后則逆轉了這一改變。這表明ROCK1能調控ROS的水平，激活炎癥通路促進M1巨噬細胞極化。但是我們并沒有進一步探究抑制ROCK1之后炎癥信號通路的變化，如NF-κB、信號轉導與轉錄激活因子1、6(STAT1、STAT6)等，這是本研究的局限性之一。后續我們將繼續研究ROCK1對巨噬細胞M1極化信號通路的調節以及M1巨噬細胞內的代謝改變，并嘗試探討ROCK1對M2巨噬細胞極化的調控和相關的機制，以期為預防或干預RSA中巨噬細胞的M1/M2極化失衡提供新的思路和參考。