PIGF和PEG3在輔助生殖妊娠與自然妊娠胎盤中的差異表達及臨床意義

鄒薇，蔣夢芬，馬天仲

(廣東醫科大學附屬醫院生殖醫學中心，湛江 524001)

輔助生殖技術(ART)是指采用醫療輔助手段使得不孕不育夫婦妊娠的技術[1]。雖然ART所涉及的各項技術不斷優化完善，但現有的ART并不能完全滿足所有不孕不育患者生育健康后代的希望，另外該項技術仍存在一定安全隱患[2]。研究發現ART子代出現神經發育受損和心臟代謝功能受損的風險增加[3]，自然流產和印記障礙等不良妊娠結局的風險也增加[4]。此外，ART顯著增加了妊娠期和圍產期并發癥的風險[5-6]，特別是妊娠期高血壓疾病的風險[7]。

胎盤是印記基因高表達的器官。迄今為止，在人類基因組中發現了100多個印記基因，其中75個在胎盤中表達，許多印記基因已被證實參與了胎兒和胎盤的發育調節作用[8-10]。胎盤容易受到各種因素的影響，ART在體外的醫源性操作過程中可能干擾子代基因的表達，進而改變胎盤結構和功能，影響胎盤母體向胎兒供應營養，對母體和胎兒均造成損傷，導致許多不良的妊娠結局，危害母胎健康[11]。因此通過文獻調研，本課題選擇了與ART子代胎盤生長發育密切相關的胎盤生長因子(placental growth factor，PIGF)和印記基因父系表達基因3(paternally expressed gene 3，PEG3)進行研究，通過檢測分析PIGF和PEG3在ART妊娠及自然妊娠胎盤中的基因、蛋白表達水平的差異，探討ART對PIGF和PEG3的影響以及對誘發妊娠不良結局的相關影響，進一步評估ART的安全性。

資料和方法

一、研究對象

收集2021年9—12月在廣東醫科大學順德婦女兒童醫院產科分娩的產婦臨床資料。

納入標準：(1)產婦年齡<35周歲；(2)單胎妊娠；(3)新生兒檢查無畸形且無明顯出生缺陷；(4)夫妻雙方染色體正常。排除標準：產婦孕前合并嚴重的內外科并發癥(如嚴重的心臟病、高血壓病、糖尿病、甲狀腺疾病等)。

根據妊娠方式不同分為自然妊娠組和ART組，兩組進行年齡、產前體質量指數(BMI)配對消除偏移，最終納入ART組113例，自然妊娠組153例。兩組各隨機收集18例胎盤，分組標記為自然妊娠組(A1-A18)，ART組(B1-B18)。兩組孕婦均簽署知情同意書，本研究經廣東醫科大學順德婦女兒童醫院倫理委員會批準。

二、主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒、Real Time PCR System反應體系(Takara，寶日醫藥生物，日本)；TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(南京諾唯贊生物)；PEG3、PIGF、GAPDH引物(上海生工生物工程公司)；過氧化物酶、抗鼠/兔IgG聚合物(北京中杉金橋)；山羊血清工作液(北京博奧森生物)；PEG3兔抗體(Affinity Biosciences，美國)；PIGF兔抗體(Proteintech，美國)；GAPDH兔抗體(上海碧云天)，PageRulerTM預染蛋白marker26616(Thermo Scientific，美國)、Genstart預染蛋白marker221(上海起發)。

ABI7500熒光定量PCR儀(Thermo Fisher，美國)；組織切片機RM2235(LEICA，德國)、OLYMPUS DP71顯微照相系統(OLYMPUS，日本)、ReadMax1200型全波長酶標儀(上海閃譜生物)。

三、研究方法

1.標本采集：胎盤娩出后，在無菌操作下收集胎盤，并立即予以稱重。剪取胎盤母體面邊緣處的胎盤組織，大小為3 cm×3 cm×3 cm，避開鈣化區，去除母體蛻膜層，將胎盤絨毛浸于常溫生理鹽水中清洗血跡，分裝成2份，一份保存于10%中性福爾馬林固定液中，另一份保存于無菌凍存管中，并在30 min內轉移至-80°超低溫冰箱中。

2.qRT-PCR檢測PIGF和PEG3的mRNA表達水平：用Trizol法抽提總RNA，用逆轉錄試劑盒獲取cDNA，選擇TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(Code No. RR820A/B)進行Real Time PCR反應。PCR引物由上海生工生物工程公司設計并合成，各引物序列見表1。反應體系為10 μl：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)5.0 μl、PCR Forward Primer(10 μmol/L) 0.4 μl、PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μl、ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)0.2 μl、RT反應液(cDNA溶液)1.0 μl及dH2O 3.0 μl。反應程序如下：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，退火&延伸60℃ 34 s，40個循環。操作過程均在冰上進行。采用SYBR Green與雙鏈DNA結合的嵌合熒光檢測法，用2-ΔΔCt法分析數據。

表1 PEG3、PIGF和GAPDH引物序列

3.免疫組化分析PIGF和PEG3蛋白定位：胎盤組織常規石蠟包埋，4 μm切片，隨后脫蠟水化，用枸櫞酸緩沖液抗原修復，滴加試劑1(過氧化物酶)與試劑2(山羊血清工作液，稀釋10倍)封閉，加入一抗工作液(PEG3 1∶200，PIGF 1∶600)，陰性對照為PBS溶液，4℃過夜孵育。加入二抗(抗鼠/兔IgG聚合物50 μl)，配制DAB顯色工作液，蘇木素復染核，梯度乙醇脫水透化，最后樹膠封片拍片。

4.Western blot檢測胎盤中PIGF和PEG3蛋白的表達水平：用RIPA裂解液提取胎盤組織蛋白后，樣品分裝2管試管，一管蛋白樣品用BCA法測定蛋白濃度，另一管蛋白樣品用Loading Buffer變性，不同標本按照具體蛋白濃度進行上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后轉至PVDF膜。室溫下放置搖床封閉1～2 h，加入一抗(稀釋度1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，每次5 min，后加入二抗(稀釋度1∶300)孵育60 min，洗膜后Tanon5200成像系統顯影。

四、統計學處理

結 果

一、兩組產婦一般資料比較

與自然妊娠組相比，ART組產婦的年齡、BMI、剖宮產比例均顯著上升(P<0.05)，而產次顯著下降(P<0.05)；ART組的分娩孕周亦顯著低于自然妊娠組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組產婦的一般資料比較[(-±s)，n(%)]

二、兩組產婦的妊娠并發癥比較

與自然妊娠組相比，ART組產婦的妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病(GDM)發生率均顯著升高(P<0.05)；兩組產婦間的胎兒生長受限、妊娠期肝內膽汁淤積癥、胎膜早破、羊水過少和前置胎盤發生率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組產婦妊娠并發癥比較[n(%)]

三、兩組新生兒基本情況比較

與自然妊娠組新生兒相比，ART組的新生兒早產、低出生體重兒率顯著升高，出生孕周顯著下降(P均<0.05)；兩組間新生兒出生體重無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 兩組新生兒基本情況比較[(-±s)，n(%)]

四、兩組產婦胎盤組織中PEG3和PIGF的mRNA表達水平比較

qRT-PCR結果顯示，ART組產婦胎盤組織中PIGF的mRNA表達水平顯著低于自然妊娠組(P<0.05)，而PEG3的mRNA表達水平在兩組間無顯著性差異(P>0.05)(表5)。

表5 兩組產婦PEG3和PIGF mRNA表達水平比較(-±s)

五、兩組胎盤組織中PEG3和PIGF蛋白表達的定位

HE染色結果顯示，ART組胎盤和自然妊娠組胎盤光鏡下大體結構正常，均存在典型的絨毛結構(箭頭所示)，胎盤血管豐富，胎盤無明顯鈣化及水腫(圖1)。

兩組均可見典型的絨毛結構(箭頭所示)，血管豐富，胎盤無明顯鈣化及水腫。圖1 兩組胎盤組織的HE染色結果

免疫組化結果顯示，PEG3蛋白主要表達于胎盤合體滋養細胞的細胞膜中(圖2)，而PIGF蛋白主要表達于胎盤的合體滋養細胞的細胞膜和細胞質中(箭頭所示)(圖3)。蛋白光密度測定結果顯示，ART組胎盤組織中PEG3蛋白的光密度值顯著低于自然妊娠組[(0.221±0.061)vs. (0.309±0.069)](P<0.05)，而PIGF蛋白的光密度值在兩組之間無顯著性差異[(0.217±0.079)vs. (0.245±0.069)](P>0.05)(圖4)。

PEG3主要表達于胎盤滋養細胞的細胞膜中(箭頭所示)。圖2 兩組胎盤組織中PEG3的免疫組化結果

PIGF主要表達于胎盤滋養細胞的細胞膜和細胞質中(箭頭所示)。圖3 兩組胎盤組織中PIGF的免疫組化結果

圖4 兩組胎盤組織中PIGF和PEG3蛋白的光密度值比較

六、兩組胎盤組織PEG3和PIGF蛋白的表達水平

Western blot結果顯示，PIGF和PEG3蛋白在ART組胎盤組織中的表達水平較自然妊娠組呈下調趨勢(圖5)。蛋白灰度值測定結果顯示，ART組胎盤組織中的PEG3蛋白灰度值顯著低于自然妊娠組[(0.154±0.633) vs. (1.203±1.380)](P<0.05)，而PIGF蛋白的灰度值有低于自然妊娠組的趨勢[(0.443±0.234) vs. (0.786±0.353)]，但差異尚無統計學意義(P>0.05)(表6)。

圖5 兩組胎盤組織中PEG3和PIGF蛋白的Western blot條帶

表6 兩組胎盤組織中PIGF、PEG3蛋白灰度值比較

討 論

文獻表明，與自然妊娠相比，ART中新鮮胚胎移植會增加子代早產、低出生體重兒的風險[12-13]，凍融胚胎移植會增加巨大兒的風險[14]，ICSI會增加子代出生缺陷和低劣的精液質量轉移到男性后代的風險[15]。體外受精與GDM、妊娠期高血壓疾病、子癇前期、妊娠期肝內膽汁淤積癥、前置胎盤、胎盤早剝、胎膜早破、早產、低出生體重的發生率以及剖宮產率顯著增加相關[16]。ART發生多胎妊娠和不良圍產期結局的風險明顯更高，包括早產、低出生體重和出生缺陷[17]。ART醫源性體外操作可能導致妊娠期并發癥及子代健康風險增加，具體機制尚未明確，本課題目標之一是探討ART與孕產婦和新生兒結局之間的關系，與自然妊娠的結果進行比較，確定ART是否顯著增加不良妊娠結局的發生率，并研究其與具體并發癥之間的相關性。采用t檢驗的方法對入組受試者的妊娠期并發癥、圍產期并發癥和新生兒結局進行研究和分析。

本研究中，首先比較了ART組和自然妊娠組產婦的一般資料，結果發現大多數ART的孕婦在沒有手術指征的情況下選擇了剖宮產。入組時已經剔除高齡孕婦可能對此結果造成的影響，而后進一步比較ART組和自然妊娠組的分娩方式和剖宮產醫學指征，數據顯示ART組中68.1%的婦女接受了剖宮產，其中大部分是擇期剖宮產，ART顯著增加了剖宮產的發生，這可能與ART孕婦經過多重障礙妊娠，孕育的子代更為珍貴有關，故人為選擇剖宮產的比例提升。但也有研究表明ART與剖宮產的發生無直接關系[18]，ART是否導致剖宮產率增加還有待進一步研究。

有文獻報道，ART的單胎妊娠比自然妊娠中的單胎妊娠發生妊娠期高血壓、子癇前期、GDM、妊娠期肝內膽汁淤積癥、產后出血、早產、低出生體重的風險增加[19-20]。本研究統計分析得出，ART可能與妊娠期高血壓、GDM的發生率顯著升高有關，與新生兒結局不良的風險增加有關，這與以往文獻報道[19-20]一致；但是對胎兒生長受限、妊娠期肝內膽汁淤積癥、胎膜早破、羊水過少和前置胎盤等的發生無明顯影響，考慮與本研究存在一些不足之處有關，如納入樣本量較少、醫院選擇較為單一，后期可以開展不同地區不同醫院的大樣本多中心研究來進一步驗證。

本課題探討了PIGF和印記基因PEG3在ART妊娠和自然妊娠胎盤中的表達差異情況。結果顯示，ART組胎盤中與妊娠期不良結局密切相關的PIGF mRNA表達下調，與生長發育相關的印記基因PEG3表達處于低水平狀態。PIGF和PEG3在兩組胎盤中mRNA與蛋白表達趨勢一致，均是ART組的表達低于正常妊娠組，但ART組PEG3的mRNA表達水平和PIGF蛋白水平雖有低表達趨勢，但是差異尚無統計學意義(P>0.05)，這可能與本實驗樣本量小有關，后期可加大樣本量繼續研究。

綜上所述，通過ART助孕的產婦，孕期發生妊娠期高血壓和GDM的幾率增加，新生兒不良結局的發生風險亦增加；ART助孕影響胎盤組織中PIGF和PEG3 mRNA及蛋白水平的表達，但是不影響胎盤結構，ART助孕對胎盤的影響還需要進一步研究。