多精受精中人卵丘顆粒細胞差異基因表達分析

王麗，趙杰*，陳秀娟，杜琛，劉芳，何江峰，梅步俊

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010030；3.河套學(xué)院，巴彥淖爾 015000)

自1978年首例試管嬰兒問世以來，輔助生殖技術(shù)(ART)得到了快速發(fā)展，促排卵、IVF及胚胎體外培養(yǎng)方面的技術(shù)水平也在不斷提高，但仍然無法避免常規(guī)IVF中出現(xiàn)的多原核(PN)現(xiàn)象。多PN合子的出現(xiàn)會降低卵母細胞利用率、減少可利用胚胎數(shù)量、降低患者妊娠機會[1]。在卵母細胞和卵泡生長發(fā)育過程中，卵母細胞與卵丘顆粒細胞及卵泡內(nèi)微環(huán)境會進行雙向的信號傳導(dǎo)，促使卵母細胞發(fā)育與成熟[2]；卵母細胞與顆粒細胞之間的密切關(guān)系使得顆粒細胞中差異基因的表達會影響卵母細胞的發(fā)育情況，進而影響到卵母細胞的受精情況。本研究通過分離受精前卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞，再根據(jù)卵母細胞的受精情況分為正常受精組與多精受精組，檢測正常受精和多精受精前顆粒細胞的基因表達情況，以期發(fā)現(xiàn)在多精受精中差異表達的基因。

資料與方法

一、研究對象

篩選2019年4月在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心因輸卵管因素導(dǎo)致繼發(fā)不孕而進行IVF-ET的病例3例為研究對象。納入標準：年齡25～26歲，月經(jīng)周期正常，基礎(chǔ)竇卵泡計數(shù)(AFC)≥7個，基礎(chǔ)FSH(bFSH)值在5～10 U/L之間。排除標準：(1)女方為卵巢低反應(yīng)者；(2)女方患有糖尿病、高血壓、甲狀腺疾病等內(nèi)分泌疾病；(3)存在子宮畸形、子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮粘膜下肌瘤等婦科疾??；(4)女方診斷為輸卵管積水；(5)夫婦一方患有其他系統(tǒng)器質(zhì)性疾??；(6)夫婦中任何一方有染色體異常。男方精液質(zhì)量符合《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)正常標準要求。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖倫理委員會審批通過，患者經(jīng)充分知情同意后簽署知情同意書，自愿捐贈部分顆粒細胞用于科學(xué)研究。

納入研究的卵冠丘復(fù)合體(OCCC)根據(jù)卵母細胞受精情況分為多精受精組和正常受精組。多精受精組即將同一患者的多PN受精，含2個極體(2Pb)+3PN及3PN以上的卵母細胞對應(yīng)的顆粒細胞合并為一管，按照患者姓氏區(qū)分分別標記為MAF1、WAF2、LAF3；正常受精組即將同一患者正常受精(2Pb+2PN)的卵母細胞對應(yīng)的顆粒細胞進行合并，分別標記為MNF1、WNF2、LNF3。

二、研究方法

1.取卵、授精、培養(yǎng)與觀察：促排卵方案按照內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心標準長方案進行，于月經(jīng)周期第21天開始每天肌肉注射促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，達菲林，Ipsen Pharman Biotech，荷蘭)0.1 mg，14 d后，當卵泡大小接近且直徑均<5 mm、E2<146.8 pmol/L、LH<10 U/L、FSH<10 U/L、子宮內(nèi)膜厚度<5 mm時，給予皮下注射重組卵泡刺激素(果納芬，默克，瑞典)75～225 U，進行促排卵。定期進行陰道超聲檢查，并測定血E2和孕酮(P)水平，評估卵泡發(fā)育情況。當B超觀察到雙側(cè)卵巢中有1～2個卵泡直徑≥18 mm時，給予肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)5 000～10 000 U，36～38 h后經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下吸出卵泡內(nèi)卵泡液及OCCC。將吸出的包含OCCC的卵泡液快速送至胚胎實驗室，在體視顯微鏡下用巴斯德吸管取出OCCC，經(jīng)培養(yǎng)液洗滌4遍后，放入含1 ml IVF-Plus受精液(Vitrolife，瑞典)的培養(yǎng)皿中，37℃、6%CO2、5%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h等待授精。精液采用密度梯度離心法聯(lián)合上游法進行分離，分離后的精液進行計數(shù)，調(diào)整精子密度為1×106條/ml前向運動精子，室溫放置。卵母細胞培養(yǎng)3～4 h后，將精子懸液制作成100 μl的微滴，精子濃度為10～20萬條/ml，將切割后的OCCC加入精子微滴中，共同過夜培養(yǎng)17 h，用拆卵管將卵母細胞周圍顆粒細胞拆除，將受精卵轉(zhuǎn)入G1-plus(Vitrolife，瑞典)微滴中，倒置顯微鏡下觀察PN及Pb排出情況并記錄，其中2Pb+2PN的受精卵為正常受精，2Pb+3個或以上PN的受精卵為多精受精。微滴繼續(xù)培養(yǎng)，加精后40 h觀察受精卵的卵裂情況，加精后64 h觀察胚胎發(fā)育情況并評級，對可移植胚胎進行移植、冷凍或囊胚培養(yǎng)。

2.顆粒細胞的采集：在授精前10 min，用機械方法對受試者的卵母細胞外圍部分顆粒細胞進行切割，獲取顆粒細胞團塊，用含80 U/ml透明質(zhì)酸酶的MOPs+5%HSA液體消化1 min，離心、洗滌兩遍，分裝入0.2 ml無菌管，-80℃冷凍保存。包裹有卵母細胞的OCCC進行微滴授精。

3. 總mRNA提取、文庫構(gòu)建、測序及數(shù)據(jù)分析：總mRNA提取、文庫構(gòu)建及測序按照北京諾禾致源科技股份有限公司標準流程進行。差異表達基因篩選采用軟件DESeq操作，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；采用GOseq軟件進行差異表達基因的基因本體論(GO)分析，P<0.05時表示在該GO條目顯著富集；并進行京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(KEGG)分析，錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.05時表示差異基因在該KEGG中顯著富集[3]。應(yīng)用STRING蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org/)中的互作關(guān)系進行差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的分析。

結(jié) 果

一、3例患者多精受精的發(fā)生情況

3例患者中，第1例M患者獲卵16枚，正常受精13枚(對應(yīng)的顆粒細胞納入MNF1管)，多精受精3枚(對應(yīng)的顆粒細胞納入MAF1管)；第2例W患者獲卵13枚，正常受精10枚(對應(yīng)的顆粒細胞納入WNF2管)，多精受精2枚(對應(yīng)的顆粒細胞納入WAF2管)；第3例L患者獲卵15枚，正常受精11枚(對應(yīng)的顆粒細胞納入LNF3管)，多精受精3枚(對應(yīng)的顆粒細胞納入LAF3管)。第2、3例患者中單PN受精或晚卵裂受精的情況未納入統(tǒng)計。

二、兩組之間差異表達的基因

1.樣本生物信息學(xué)分析：本實驗對6個樣本的cDNA文庫進行高通量測序和生物信息學(xué)分析，得到部分原始數(shù)據(jù)與去雜后的數(shù)據(jù)信息，詳見表1。多精受精組與正常受精組比較，存在的差異表達基因共139個，其中顯著上調(diào)的基因106個，顯著下調(diào)的基因33個(圖1)。顯著上調(diào)及顯著下調(diào)的前10個基因信息詳見表2、表3。

表1 樣品測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估情況

紅色：上調(diào)基因；綠色：下調(diào)基因；藍色：無顯著性差異表達的基因。圖1 三名患者中多精受精組與正常受精組比較差異基因表達火山圖

表2 多精受精組與正常受精組比較顯著上調(diào)的Top10基因信息

表3 多精受精組與正常受精組比較顯著下調(diào)的Top10基因信息

2.同一患者中多精受精組與正常受精組比較：MAF1與MNF1比較，存在顯著表達差異的基因有694個，其中207個基因上調(diào)，487個基因下調(diào)(圖2)；WAF2與WNF2比較，存在顯著表達差異的基因有886個，其中596個基因上調(diào)，290個基因下調(diào)(圖3)；LAF3與LNF3比較，存在顯著表達差異的基因有805個，其中498個基因上調(diào)，307個基因下調(diào)(圖4)。

紅色：上調(diào)基因；綠色：下調(diào)基因；藍色：無顯著性差異表達的基因。圖2 MAF1與MNF1比較差異基因表達火山圖

紅色：上調(diào)基因；綠色：下調(diào)基因；藍色：無顯著性差異表達的基因。圖3 WAF2與WNF2比較差異基因表達火山圖

紅色：上調(diào)基因；綠色：下調(diào)基因；藍色：無顯著差異表達的基因。圖4 LAF3與LNF3比較差異基因表達火山圖

三、差異表達基因GO及KEGG分析

對差異基因進行GO功能注釋，分析結(jié)果顯示，其分子功能主要參與轉(zhuǎn)錄因子活性(GO0003712)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(GO0000989)、蛋白質(zhì)鏈接(GO0000988)，生物過程主要參與細胞分化(GO030154)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(GO0007267)(圖5)。KEGG富集分析顯示，差異表達基因信號通路在核糖體(hsa03010)、細胞因子受體相互作用(hsa04060)、細胞分化(hsa04380)、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝(hsa00270)等通路上富集(圖6)。上調(diào)的差異基因主要涉及P53信號通路、PI3K-AKT信號通路、肌動蛋白細胞骨架信號通路和HIPPO信號通路。表達上調(diào)的基因BMP2、SESN3、CDK6、GRLF1(ARHGAP35)與多精受精相關(guān)。

紅色：上調(diào)基因；藍色：下調(diào)基因。圖5 存在差異表達的基因功能注釋

圖6 差異基因KEGG富集分析(橙色表示富集的基因)

討 論

哺乳動物的卵母細胞在體內(nèi)生理條件下發(fā)生多精受精的幾率較低，但在體外操作下，多精受精發(fā)生的幾率較高。過往的研究多集中在臨床操作的技術(shù)及方法上，且由于人類卵母細胞不易獲得及倫理的限制，因此對卵母細胞發(fā)生多精受精的機制進行基因水平的研究很少。因卵丘顆粒細胞與卵母細胞通過縫隙連接進行雙向的信號交流[4-9]，所以通過研究與卵母細胞有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的卵丘顆粒細胞的基因轉(zhuǎn)錄水平差異或許可以為研究卵母細胞的多精受精原理提供另外一條思路。

體外操作中多PN卵母細胞的出現(xiàn)可能是由于多條精子入卵、卵母細胞第二極體未排出、PN碎裂、入卵精子多倍體等原因造成的。這些情況的發(fā)生與卵母細胞的發(fā)育成熟度異常、卵母細胞透明帶異常、卵泡液中激素水平過高或過低導(dǎo)致的卵母細胞異常以及精子濃度過高、體外培養(yǎng)條件不適導(dǎo)致的操作異常有關(guān)。

精子入卵后，卵母細胞會發(fā)生皮質(zhì)反應(yīng)從而阻止多精入卵，若卵母細胞成熟度不足或過熟，皮質(zhì)反應(yīng)容易發(fā)生異常。未成熟卵母細胞由于細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜與透明帶未發(fā)育成熟而不能發(fā)生徹底的皮質(zhì)反應(yīng)與透明帶反應(yīng)；但卵母細胞過熟后會使皮質(zhì)顆粒內(nèi)容物排出，皮質(zhì)反應(yīng)發(fā)生不全，導(dǎo)致多精受精。本研究中，多精受精組中與卵母細胞成熟度相關(guān)的差異基因有CDK6、BMP2基因。CDK基因家族參與調(diào)節(jié)哺乳動物細胞周期和轉(zhuǎn)錄，對卵母細胞的核成熟和轉(zhuǎn)錄活性具有重要作用，是恢復(fù)卵母細胞減數(shù)分裂的重要物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)細胞G1/S期進程[10-12]。作為BMP亞家族、TGF-β超家族的成員之一，BMP2與GDF9一起在卵母細胞成熟過程中發(fā)揮作用[13]，BMP2與細胞膜上的受體結(jié)合并通過HIPPO信號通路BMPs-Smad1/4系統(tǒng)使Smad1/4磷酸化，影響卵母細胞受精，BMP2水平可作為卵母細胞質(zhì)量與受精的預(yù)測指標[14-16]。

MDM2-p53-SESN信號通路可能通過SESN3基因調(diào)控卵母細胞氧化、衰老以及DNA損傷和修復(fù)過程。PI3K/AKT信號通路中PI3K激活磷酸化并進一步激活A(yù)KT，其定位于細胞膜，與細胞靜止、增殖有關(guān)。PI3K/AKT信號通路促進細胞周期發(fā)育并改善細胞增殖從而影響卵母細胞受精。。

p53基因是重要的腫瘤抑制基因之一[17-19]，在多個通路中發(fā)揮作用。在MDM2-p53-SF1通路中，p53影響著小鼠卵母細胞的成熟和受精[20]。在人卵巢顆粒細胞中，p53通過MDM2-p53-SESN信號通路對下游基因SESN3進行調(diào)節(jié)[21-22]。在本研究中，作為抗氧化基因，SESN3基因有差異表達，其是否可以通過調(diào)控卵母細胞氧化、衰老以及DNA損傷和修復(fù)過程影響受精結(jié)局，有待進一步的證明。

卵母細胞未成熟或過熟會導(dǎo)致細胞內(nèi)肌動蛋白動力學(xué)異常以及受精時細胞內(nèi)鈣離子釋放異常。肌動蛋白細胞骨架是一種通用的聚合應(yīng)力，是產(chǎn)生細胞中心體、細胞核和紡錘體所必需的聚合應(yīng)力[23]，還參與細胞遷移、胞質(zhì)分裂等過程[24-27]。GRLF1(ARHGAP35)基因可以抑制Rho活性，通過GRLF1-Rho-mDia信號通路調(diào)控細胞內(nèi)肌動蛋白聚合應(yīng)力纖維，調(diào)控肌動蛋白細胞骨架[27]。在本研究中，多精受精組中GRLF1基因的表達顯著上調(diào)。另外，過熟的卵母細胞在受精時會發(fā)生細胞內(nèi)鈣釋放模式的改變以及肌動蛋白動力學(xué)的異常，導(dǎo)致多精受精率增高[28-29]。本研究也篩選出與鈣離子釋放相關(guān)的基因——TANC1基因顯著上調(diào)，TANC1是重要的突觸支架蛋白，在調(diào)節(jié)突觸棘密度和興奮性突觸強度中起關(guān)鍵作用，可能通過改變細胞內(nèi)鈣釋放模式以及肌動蛋白動力學(xué)，影響受精結(jié)局。激素刺激不當也會引起卵母細胞發(fā)育異常導(dǎo)致多精受精，本研究篩選出的在多精受精組中表達上調(diào)的IGRBP5基因是促進細胞有絲分裂的敏感基因，受卵泡刺激素的影響。

本研究最初設(shè)計時為防止各組中取樣細胞過少導(dǎo)致測序結(jié)果出現(xiàn)偏差，故將同一個體的相同受精類型卵母細胞對應(yīng)的顆粒細胞進行合并，篩選差異基因表達情況，這可能會使測序結(jié)果的準確性存在偏差。下一步研究將對單精受精、0PN晚卵裂、多精受精每個卵母細胞的卵丘細胞轉(zhuǎn)錄組進行測序，分析各種異常受精情況的差異基因表達情況。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，多精受精組與正常受精組比較顆粒細胞存在基因表達差異，其中，顯著上調(diào)的基因集中在與卵母細胞生長、成熟及凋亡、激素分泌、免疫、腫瘤發(fā)生、有絲分裂及受精過程相關(guān)的通路上，主要涉及p53信號通路、PI3K-AKT信號通路、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)控信號通路、HIPPO信號通路；顯著下調(diào)的基因則主要集中在細胞物質(zhì)代謝及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)過程。本研究通過對差異基因表達進行分析，這可能為后續(xù)開展生殖過程中異常受精發(fā)生的影響因素研究提供一定的參考。