魯氏毛霉與乳酸菌復配發酵對咖啡奶酪風味的影響

洪賓，白如彬，任慧玲，姜珊珊，烏日娜,2,3，史海粟,2,3*

1(沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽，110866) 2(遼寧省食品發酵技術工程研究中心，遼寧 沈陽，110866) 3(沈陽市微生物發酵技術創新重點實驗室，遼寧 沈陽，110866)

奶酪又叫干酪，是一種以乳、稀奶油、脫脂乳、酪乳或其混合物為原料，向其中加入少量發酵劑和凝乳酶經過發酵，使酪蛋白凝聚，排除乳清，待成熟后制成的一種高營養的發酵乳制品[1-2]。奶酪是一個復雜的微生物生態系統，由多種不同的微生物組成[3]。例如，在奶酪生產中，乳酸菌用作產酸的起始培養物，而酵母、霉菌、其他細菌和異型發酵乳酸桿菌則參與成熟過程[4]。此外，真菌菌株有助于形成特定的感官特征。使用可見真菌菌絲體發酵奶酪是奶酪生產中最早的方法之一[5]。

霉菌奶酪雖很受歡迎，但并未大規模生產(占全球奶酪總產量的3%，占歐洲總奶酪產量的8%)[6]。霉菌奶酪又分為2個亞型，(1)是表面成熟霉菌奶酪，如卡門培爾奶酪和布里干酪，通常由卡門貝蒂青霉催熟，形成天鵝絨般的白色外皮。(2)是內部成熟霉菌奶酪，如藍紋奶酪，其作為一款高蛋白、高維生素、高鈣和高礦物質以及具有獨特風味的即食性食品，是國際市場上交易量最大的乳制品之一[7-8]。李昂等[9]探究了雅致放射毛霉添加量對牦牛霉菌奶酪品質的影響，發現當發酵劑的添加量為0.3%，發酵6 d時，牦牛霉菌奶酪的品質最佳。對卡門貝爾青霉和乳酸菌聯合發酵的干酪的揮發性物質進行代謝組學分析，發現乳酸菌對卡門貝爾霉菌產生的支鏈脂肪酸、月桂酸、油酸、亞油酸、支鏈醇等揮發性風味物質有增強作用[10]。

現有的咖啡發酵乳制品主要有咖啡乳酒和咖啡發酵含乳飲料，且發酵菌種單一，口感與風味較為局限。本研究將我國傳統腐乳發酵菌魯氏毛霉與復合乳酸菌復配，制作一種新型的奶酪發酵劑，并將咖啡粉用于奶酪制作中，開展咖啡奶酪的加工工藝及其品質研究。制備的咖啡奶酪產品，有助于滿足國內對奶酪及其新品的需求，以期為拓寬奶酪產品市場提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：純牛奶，輝山乳業有限責任公司；腐乳曲、復合乳酸菌(保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1)、白砂糖，安琪酵母股份有限公司；咖啡粉，日本AGF株式會社；凝乳酶，深圳富晟生物科技有限公司；CaCl2，河南萬邦實業有限公司；NaCl，中鹽長江鹽化有限公司，以上材料均為食品級。實驗其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DHP-9162電熱恒溫培養箱，寧波樂電儀器制造有限公司；7890A-5975A氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫科技有限公司；CR21 N高速冷凍離心機，日本日立株式會社；SA402B型電子舌，日本Insent公司；K9840自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發酵劑菌種復配比例篩選

將篩選得到的魯氏毛霉與復合乳酸菌組合按照不同復配比例分組，分別按3%的量接種于牛乳中，混合均勻，37 ℃培養，測定凝乳時間、凝乳酸度、凝乳pH值、乳清OD值和奶酪出品率，并觀察凝乳氣味、組織狀態，綜合比較篩選出最優比例組合。

凝乳時間：記錄37 ℃下不同復配比例的凝乳時間；凝乳酸度：根據GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》方法進行測定，結果用吉爾涅爾度/°T表示；凝乳pH值：采用pH計于室溫下直接測定；乳清OD值：將收集到的乳清加水稀釋10倍后，用紫外分光光度計測定其在λ=500 nm處的吸光值[8]；奶酪出品率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：x，奶酪的出品率，%；m1，奶酪排乳清之前的質量，g；m2，奶酪排乳清之后的質量，g。

1.3.2 咖啡奶酪工藝流程

鮮牛乳→添加咖啡→添加發酵劑→牛乳酸化→添加CaCl2→添加凝乳酶→靜置凝乳→切割→升溫攪拌→入模排乳清→加鹽后發酵→冷藏→成品

1.3.3 單因素試驗

選取發酵劑添加量、咖啡添加量、白砂糖添加量、凝乳酶添加量、CaCl2添加量以及凝乳溫度等幾個不同因素設計單因素試驗，其余因素取中間值。分別從奶酪的凝乳時間、出品率、乳清OD值、感官評分以及凝乳的質地與氣味等幾個方面進行評價，確定最佳的單因素水平，單因素試驗水平見表1。

表1 單因素試驗設計Table 1 Single-factor experimental design

1.3.4 響應面法優化

在單因素試驗的基礎上，以奶酪的出品率為指標，考察發酵劑添加量、咖啡添加量以及凝乳溫度對奶酪出品率的影響，確定響應面優化最佳因素水平。因素與水平見表2。

表2 響應面因素水平設計Table 2 Response surface experiment factor and level design

1.3.5 感官評價

感官評分標準如表3所示。

表3 咖啡奶酪感官評分標準Table 3 The sensory scoring standards of coffee cheese

1.3.6 電子舌評價

參考王嬙[11]的方法，采用電子舌對不同后發酵時期復配發酵咖啡奶酪的主要風味進行分析，并以復合乳酸菌發酵樣品作為對照。

1.3.7 理化指標測定

水分：按照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》；灰分：按照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》第一法進行測定；蛋白質：按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》；脂肪：按照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》第一法進行測定；pH值：稱取奶酪樣品研磨后，與蒸餾水以質量比1∶1混合后均質2 min，用pH計測定。

1.3.8 質構分析

參考郭琳儀[12]的方法，采用質構儀對奶酪進行質構分析(texture profile analysis，TPA)。將奶酪樣品切割成1 cm3的小塊，分別測定復配發酵咖啡奶酪的各項性能，并以復合乳酸菌發酵咖啡奶酪作對照。

1.3.9 揮發性風味物質測定

采用頂空固相微萃取，稱取5 g樣品，放入20 mL頂空瓶內，參考王嬙[11]的方法，略作修改，對奶酪的揮發性風味物質進行測定。

1.3.10 游離脂肪酸含量測定

準確稱取5 g奶酪樣品，將樣品放入研缽中充分研磨，全部轉移至圓底燒瓶中，參考史海粟[13]的方法對游離脂肪酸進行提取并甲酯化后，進GC-MS測定。

1.4 數據分析

每個試驗重復3次，以平均值±標準差表示。采用單因素方差分析(ANOVA)，在5%的概率水平上進行平均值比較的鄧肯檢驗方法(P<0.05)。數據統計采用WPS Office 2021軟件，作圖采用GraphPad Prism 8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 發酵劑復配比例對凝乳特性的影響

以發酵乳的凝乳時間、凝乳酸度、凝乳pH值、奶酪的出品率、乳清OD值等為評價指標，分別對不同復配比例的樣品進行評價。結果表明(表4)，當毛霉∶復合乳酸菌=2∶1時，咖啡奶酪的凝乳時間為(30±5) min，乳清OD值為(0.2±0.01)，出品率為(20.15±0.74)%，綜合評分高于其他比例。奶酪的凝乳時間太長會導致生產效率低下，不利于工業化生產并且染菌幾率也大大增加[14]。而乳清的OD值越高說明奶酪凝乳越差，固形物流失較多，導致奶酪的出品率較低[15]。

表4 發酵劑復配比例對凝乳特性的影響Table 4 Effect of starter compound ratio on the characteristics of curd

研究毛霉與復合乳酸菌不同復配比例下凝乳的狀態與氣味發現(表5)，隨著毛霉的配比降低，奶酪的凝乳狀態呈先上升后下降的趨勢，當毛霉與復合乳酸菌的比例為2∶1時，奶酪的凝乳狀態最佳。凝乳狀態的好壞直接影響了奶酪的品質以及感官評分。因此，良好的凝乳質地對奶酪的生產至關重要。在對凝乳的各項評價指標進行綜合考量后，發酵劑的最優復配比例確定為毛霉∶復合乳酸菌=2∶1。

2.2 單因素試驗結果

分別對奶酪的凝乳時間、出品率、乳清OD值、感官評分以及凝乳的質地與氣味等幾個方面進行評價，并觀察不同凝乳溫度下凝乳的質地、氣味和色澤的變化，確定最佳的單因素水平。單因素試驗結果表明，咖啡奶酪的最佳工藝條件是：發酵劑、咖啡、白砂糖、凝乳酶和CaCl2的質量分數分別為2.5%、1%、4%、0.25%和0.2%，凝乳溫度33 ℃。

表5 發酵劑復配比例對凝乳質地與氣味的影響Table 5 Effect of starter compound ratio on the texture and smell of curd

2.3 響應面結果

在單因素試驗的基礎上，以發酵劑添加量(A)、咖啡添加量(B)以及凝乳溫度(C)等3個因素為自變量，咖啡奶酪的出品率(Y)為響應值，采用Box-Behnken對咖啡奶酪的工藝參數進行優化。響應面試驗結果與分析見表6，方差分析見表7。

表6 咖啡奶酪工藝條件優化響應面試驗設計及結果Table 6 Design and results of response surface experiments for the optimization of coffee cheese processing

經Design Expert 10.0.7軟件對表6中的數據進行多元回歸擬合，得到咖啡奶酪的出品率(Y)的響應面回歸方程為：

Y=19.70+0.034A+0.25B+0.36C+0.045AB-0.23AC-0.098BC-0.69A2-0.84B2-0.51C2

由表7可知，數據模型具有顯著性(P<0.05)，失擬項檢驗P=0.152>0.05，不顯著，說明試驗模型能很好地擬合實際情況，可以用于咖啡奶酪的工藝參數優化。3個因素對咖啡奶酪感官評分影響的主次順序依次為C>B>A，即凝乳溫度>咖啡添加量>發酵劑添加量，其中二次項B2對結果影響極顯著(P<0.01)，二次項A2對結果影響顯著(P<0.05)，其他項則對結果影響不顯著(P>0.05)。

根據咖啡奶酪出品率回歸方程得出不同因子的響應面分析圖，結果見圖1。因素A與因素B之間以及因素B與因素C之間所形成的響應面曲面坡度在兩因素交互作用響應面圖中更為陡峭，說明因素A與因素B以及因素B與因素C之間具有更強的交互作用。

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Analysis of variance for regression models

通過Design Expert 10.0.7軟件分析確定咖啡奶酪的最佳發酵工藝條件為發酵劑添加量2.5%，咖啡添加量1%，凝乳溫度33 ℃，在此條件下，咖啡奶酪的出品率為19.55%。

a-發酵劑添加量與咖啡添加量；b-發酵劑添加量與凝乳溫度；c-咖啡添加量與凝乳溫度圖1 各因素交互作用對咖啡奶酪出品率影響的響應面圖Fig.1 Response surface plot of interaction of various factors on the yield of coffee cheese

2.4 電子舌測定結果

分別對復配發酵咖啡奶酪和復合乳酸菌發酵的咖啡奶酪進行電子舌測定。由電子舌自帶的分析軟件將傳感器電勢值轉化成味覺值，最后3次測得的味覺的平均值如圖2所示，2種咖啡奶酪的苦味均隨著發酵時間的延長，而不斷減小，但對照組的苦味整體上大于復配發酵組。隨著發酵時間的延長，酸味和甜味也在不斷減小。復配發酵的樣品與對照組相比味覺更加柔和且鮮味更足。奶酪中的苦味和澀味可能是由咖啡產生的。

a-試驗組；b-對照組圖2 電子舌檢測結果的雷達圖Fig.2 Radar chart of electronic tongue detection results

2.5 理化指標測定結果

如表8所示，奶酪的水分含量隨著發酵時間的延長逐漸減少。一方面由于游離水的蒸發使得水分流失[16]，另一方面是在酶和微生物的作用下蛋白質逐漸被分解，奶酪的網狀結構受到破壞，產生大量的自由水[9,17]。試驗組的蛋白質含量隨著發酵時間的延長而逐漸減少，這可能是由于毛霉的加入，增強了分解蛋白質和脂肪的能力，蛋白質被分解成肽、游離氨基酸等小分子化合物，造成蛋白質含量下降[18]。2種奶酪的脂肪含量均隨著發酵時間的延長逐漸減少，由于毛霉的脂肪酶分泌能力較強，從而促進脂肪分解為脂肪酸，而脂肪分解是脂肪酸的主要來源[19]。pH隨著發酵時間的延長先減小后增大。后發酵前期由于乳糖分解產生乳酸的作用，同時脂肪被分解成脂肪酸，導致奶酪pH值降低；隨著后發酵時間的延長，霉菌在奶酪表面不斷生長并產生蛋白水解酶，蛋白質分解產生NH4+的反應處于優勢，NH4+中和一部分游離氫離子，使得成熟后期pH值保持不變或呈上升趨勢[20-21]。

表8 咖啡奶酪不同理化指標測定結果

2.6 質構分析結果

分別對2種咖啡奶酪的質構特性進行測定(圖3)，發現2種奶酪的硬度、內聚性、彈性和膠著性均隨著發酵時間的延長而逐漸增大。隨著發酵時間的延長，奶酪中的水分不斷減少，導致奶酪硬度增大。并且毛霉的加入增強了分解蛋白質的能力，破壞了蛋白質的網狀結構，使得奶酪結構松散，彈性有所損失。而奶酪的咀嚼性隨著發酵時間的延長而不斷降低，無論奶酪類型如何，成熟過程中咀嚼性都會下降，并且該參數值的降低會繼續增加蛋白質水解，導致酪蛋白網絡狀結構松散[22]。

a-硬度；b-內聚性；c-彈性；d-膠著性；e-咀嚼性圖3 咖啡奶酪質構隨后發酵時間的變化Fig.3 Changes in the textures of coffee cheese during post fermentation 注：不同小寫字母代表顯著性差異，P<0.05

2.7 揮發性風味物質測定結果

采用GC-MS對咖啡奶酪成品的揮發性風味物質進行測定，由圖4-a可知，復配發酵咖啡奶酪風味物質的種類要多于對照組樣品，如亞油酸、月桂酸乙酯、癸酸甲酯、月桂酸甲酯等風味物質在對照組樣品中均未檢測到。而復配發酵的奶酪樣品中亞油酸的含量達到了(433.28±5.79) mg/100 g，月桂酸乙酯的含量為(84.25±4.61) mg/100 g，癸酸甲酯和月桂酸甲酯的含量分別達到了(371.13±4.24) mg/100 g和(91.88±3.22) mg/100 g。且復配發酵樣品中的丁酸、月桂酸、肉豆蔻酸和油酸等物質的含量均大于對照組，丁酸和月桂酸的含量分別為(124.90±1.05)和(507.30±7.58) mg/100 g，是對照組的10倍。因此，復配發酵咖啡奶酪的風味更加豐富。

2.8 游離脂肪酸含量測定結果

對成品的咖啡奶酪的游離脂肪酸進行測定，如圖4-b所示，共檢測出10種主要脂肪酸。其中，棕櫚酸的含量最高，分別達到了(5.73±0.36)和(8.16±0.14) mg/100 g。其次為硬脂酸，含量分別為(6.78±0.12)和(7.19±0.10) mg/100 g。結果顯示，復配發酵樣品的不飽和脂肪酸含量明顯高于對照組。其中，亞油酸含量為(0.90±0.07) mg/100 g，是對照組的8倍。由于毛霉的加入產生了更多的脂肪酶，增強了分解脂肪的能力。多不飽和脂肪酸除了具有基本的營養功能外，還具有生理功能，可以降低患慢性病的風險。這些功能性多不飽和脂肪酸具有柔韌性、流動性和選擇性透膜特性，因此對人類健康具有很高的生理和治療意義[23-24]。

a-揮發性風味物質；b-游離脂肪酸圖4 咖啡奶酪中的揮發性風味物質與游離脂肪酸含量Fig.4 Content of volatile flavor substances and free fatty acids in coffee cheese

3 結論

將我國傳統腐乳發酵菌魯氏毛霉與復合乳酸菌復配，制作一種新型的奶酪發酵劑，并將咖啡粉用于奶酪制作中，開展咖啡奶酪的加工工藝及其品質研究。試驗結果表明，復配發酵劑對咖啡奶酪的品質及風味均有所提高。復配發酵劑菌種間的互作關系、復配發酵劑導致風味變化的機理以及其在其他類型奶酪中的應用等還有待進一步研究。所制備的咖啡奶酪產品有助于滿足國內對奶酪需求量的增加，和人們對上市新品的需求，為我國奶酪產品的開發利用提供一定的理論和實踐基礎。