殼聚糖-抗菌肽抑菌膜的制備及其在再制干酪貯藏保鮮中的應用

董晶，滿都拉，孫子羽，董力源，陳忠軍

(內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特，010018)

干酪水分含量高，營養價值豐富，在貯藏期間表面易受霉菌、酵母菌和細菌的污染，影響其物理、感官和化學特性，降低干酪的質量[1]。目前干酪采用的聚乙烯、聚酰胺等包裝材料是不可生物降解和不可食用的，會導致嚴重的生態問題，在這種情況下，以生物聚合物(如多糖)、天然脂質等為主要材料，輔以天然來源(抗菌肽、納他霉素和溶菌酶等)的抑菌劑制備的可食性抑菌膜成為了新活性包裝材料的替代來源[2]。DIVSALAR等[3]研究表明，使用負載乳酸鏈球菌素的纖維素-殼聚糖-氧化鋅納米復合膜對干酪進行涂膜處理，可以抑制干酪表面微生物的生長。

殼聚糖是一種陽離子多糖，從甲殼類或真菌中獲得。由于其良好的成膜性能和可生物降解性，被廣泛應用于食品包裝材料，將其與抑菌成分復配可提高抑菌膜的抗菌活性[4]。明膠是膠原的部分水解產物，具有良好的生物相容性和可降解性，但明膠膜具有較差的機械性能。抗菌肽是一類由乳酸菌分泌的對腐敗菌或病原菌具有抑制活性的多肽，具有良好的生物安全性及抑真菌活性，可抑制腐敗真菌的生長和延長食品的貨架期[5]。有關乳酸菌源抗菌肽和多糖復配對干酪保鮮的研究尚未見報道。本課題組通過前期的大量工作，從內蒙古傳統發酵食品中分離篩選出1株具優良特性的乳桿菌，其分泌的抗真菌肽對工業常見致腐或致病性酵母、霉菌具有良好的殺菌活性，具有廣譜抗真菌特性且物理性質穩定[6]。因此，本研究制備殼聚糖-明膠復合膜，并添加抗菌肽制備抑菌膜，以提高其機械性能及抑菌效果。通過研究抑菌膜對干酪貯藏期間品質的影響，揭示其對干酪的保鮮效果，為可食性干酪包裝材料進一步開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

再制干酪(水分含量55.25%)，市售；殼聚糖(脫乙酰度>95%)，北京酷來搏科技有限公司；明膠(凍力250 g，食品級)，浙江一諾生物科技有限公司；丙三醇(含量≥99.0%)、冰乙酸，天津市鑫鉑特化工有限公司；MRS肉湯、葡萄糖、酵母提取粉、大豆蛋白胨、孟加拉紅選擇培養基，廣州環凱生物試劑有限公司；葡聚糖凝膠G-100，北京索萊寶科技有限公司。

白假絲酵母(Candidaalbicans)、大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 11775-3、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CMCC 26003-3，中國普通微生物菌種保藏管理中心；乳桿菌ALCA-4，分離自內蒙古傳統發酵食品，于本實驗室保存。

26 mm×50 cm凝膠過濾色譜柱，北京瑞達恒輝科技發展有限公司；MYP11-2A磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；DHG-9240A鼓風干燥箱、GHP-9080恒溫培養箱，上海一恒科技儀器有限公司；XLW-EC拉伸強度儀，濟南蘭光機電技術有限公司；Konica CR-10分光測色儀，日本柯尼卡美能達光電股份有限公司；TA-XT plus質構儀，英國SMS公司。

1.2 抗菌肽粉的制備

將4.0%(體積分數)乳酸菌在MRS培養基中置于37 ℃恒溫培養箱培養24 h，發酵液通過6 000×g離心20 min，所得上清液抽濾過0.22 μm濾膜，將濾液質量濃度調節為50 μg/mL作為上樣樣品，參照趙潔[7]的方法，使用凝膠過濾色譜柱對抗菌肽進行初步純化，以白假絲酵母菌作為指示菌株，測定其抑菌活性。將有抑菌性的粗提液收集，用5 kDa超濾離心管濃縮(4 000×g，30 min)，經冷凍干燥處理獲得抗菌肽粉，備用。

1.3 殼聚糖復合膜制備

根據前期單因素試驗分析可知，殼聚糖、明膠及甘油的體積分數對殼聚糖復合膜的性能影響較大。因此，本試驗在單因素試驗的基礎上，對影響殼聚糖復合膜成膜工藝效果的因素進行正交試驗，優化成膜工藝條件。所選因素水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 L9(34) Orthogonal test factors and levels

1.4 最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)

以白假絲酵母菌作為指示菌，采用二倍稀釋法[8]對抑菌膜液的最小抑菌濃度進行測定。

1.5 抑菌膜制備

選取濃度為2×MIC抗菌肽添加到殼聚糖復合膜液中，制備抗菌肽抑菌復合膜液。于60 ℃用磁力攪拌器攪拌1 h，靜置 30 min，不斷攪拌至膜液完全溶解，形成均勻、透明的膜液，在室溫下靜置脫泡后制得復合膜液。取復合膜液倒入干燥玻璃模具中，在50 ℃條件下置于鼓風干燥箱，冷卻后將干燥復合膜揭下，置于相對濕度約65%的恒溫恒濕箱中，25 ℃平衡至少48 h，備用。

1.6 抑菌膜特性研究

1.6.1 抗菌活性測定

采用雙層瓊脂平板擴散法測定復合膜的抑菌性。在酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YEPD)培養基表面均勻涂布100 μL培養至對數期的指示菌菌懸液(白假絲酵母菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌懸液)(約106CFU/mL)，維持15 min后，將200 μL膜液打入涂布菌液的固體培養基的牛津孔內。置于30 ℃恒溫培養箱中培養24 h，測定抑菌圈直徑。

1.6.2 機械性能測定

參照GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的測定 第3部分：薄塑和薄片的試驗條件》，采用拉伸強度儀進行測試。夾具間距50 mm，拉伸速度50 mm/min。每組膜樣重復測定3次，取平均值。

1.7 復合膜對干酪保鮮效果評價

在無菌條件將干酪切片(1.5 mm×20 mm×23 mm)，在紫外線下照射10 min進行表面殺菌處理[9]。用制備好的抑菌膜進行包裝，然后置于(25±1)℃貯藏。未加入抗菌肽的殼聚糖復合膜作為陰性對照，每組處理3個樣取平均值。每2 d取樣1次，測定指標。

1.7.1 指標測定

1.7.1.1 水分含量

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定 直接干燥法》測定。每組樣品平行測定3次取平均值。

1.7.1.2 色度

采用分光測色儀測定貯藏過程中抑菌膜包裝干酪樣品的L*(亮度)、b*(藍-黃)值。測定之前，先使用標準白板校正，重復3次，求平均值。

1.7.1.3 質構特性

采用質構儀測定。測定時，測前、測中及測后速度均為 1.00 mm/s，下壓距離為 10 mm，間隔時間10 s，壓縮百分比為 75%，觸發力0.005 kg，探頭類型為P/36 R。每組樣品重復測定3次，求平均值。

1.7.1.4 菌落總數

參照GB 4789.2—2016 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》進行測定。

1.7.1.5 霉菌、酵母菌總數

參照GB 4789.15—2016 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》進行測定。

1.8 數據處理

采用SPSS 19.0軟件對數據進行Duncan單因素方差分析，當P<0.05時，表示具有顯著性差異。并采用Origin Pro 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 正交試驗優化殼聚糖復合膜的成膜工藝

前期單因素試驗研究表明，對膜的機械性能影響較大的因素為殼聚糖濃度、明膠濃度和甘油濃度，且其濃度分別為1.5%、2.0%、0.3%時機械性能較好。在此基礎上設計L9(34)正交試驗，測定其機械性能，結果如表2所示。

表2 殼聚糖復合膜成膜工藝正交試驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal test design of chitosan composite film

從表2極差(R)分析結果可以看出，以拉伸強度為考察指標，可以確定各因素對復合膜性能影響的主次順序分別為：RB>RC>RA，即明膠含量對復合膜的拉伸強度影響最大，最大極差為14.073，甘油含量影響性能次之，影響性能最小的是殼聚糖含量；此時較優組合為A3B1C1，即φ(殼聚糖)為1.75%，φ(明膠)為1.75%，φ(甘油)為0.25%。

以斷裂伸長率為考察指標，影響復合膜性能的各因素主次順序為RA>RB>RC，即殼聚糖含量對復合膜的斷裂伸長率影響最大，最大極差為4.320，明膠含量影響性能次之，影響性能最小的是甘油含量；此時較優組合為A1B3C3，即φ(殼聚糖)為1.25%，φ(明膠)為2.25%，φ(甘油)為0.35%。

不同的考察指標中，對復合膜性能的各影響因素的主次順序各有不同。比較R值大小可知，B對拉伸強度的影響更為顯著，因此選取拉伸強度中B因素的較優水平為1.75%；對于斷裂伸長率這個評價指標，A的影響最顯著，因此選取斷裂伸長率中A因素的較優水平為1.25%。對于拉伸強度來說，φ(甘油)=0.25%，而對于斷裂伸長率而言，φ(甘油)=0.35%，發現甘油體積分數在兩個評價指標中各不相同，因此選取中間值0.3%。綜上考慮得出最優成膜工藝組合為A1B1C2。

極差分析結合方差分析得出，試驗的較優條件為A1B1C2，即φ(殼聚糖)1.25%，φ(明膠)1.75%，φ(甘油)0.3%。以此條件制備的復合膜的性能拉伸強度為(70.69±0.50) MPa、斷裂伸長率為(12.69±0.12)%。方差分析結果如表3和表4所示。F檢驗結果表明，殼聚糖、明膠和甘油含量對殼聚糖復合膜的機械性能的影響均有顯著性差異(P<0.05)。

表3 拉伸強度方差分析表Table 3 Variance analysis of the tensile strength

表4 斷裂伸長率方差分析表Table 4 Variance analysis of elongation at break

2.2 抑菌膜最小抑菌濃度測定

采用二倍稀釋法在96孔板上測定抑菌膜對白假絲酵母菌的MIC。30 ℃培養24 h后，在膜液質量濃度≥160 mg/mL的孔中沒有觀察到孔板中長出白色菌絲，因此，最小抑菌質量濃度為160 mg/mL。

3）化學反洗。MBR每運行一周進行一次化學反洗，化學反洗的過程與在線反洗時類似，不同的是將反洗泵先后切換至次氯酸鈉及氫氧化鈉溶液槽、檸檬酸溶液槽，分別將清洗藥品打入反洗水管內。次氯酸鈉有助于去除在膜上的有機附著物、檸檬酸則有助于去除無機結垢物。

2.3 抑菌膜的特性研究

2.3.1 抑菌膜的抑菌活性

在復合膜液中加入2×MIC抗菌肽制備抑菌膜，以白假絲酵母菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為指示菌研究了其抑菌效果。由表5可知，與復合膜相比，抑菌膜具有良好的抑菌活性，且抑菌效果具有顯著性差異(P<0.05)。段星星等[10]將抗菌肽添加至明膠中制備可食性抑菌薄膜并研究其抑菌作用，結果也發現加入抗菌肽后薄膜的抑菌效果明顯增強。

表5 抑菌膜的抗菌活性Table 5 Antimicrobial activity of antimicrobial peptides films

2.3.2 抑菌膜的機械性能

與復合膜相比，加入2×MIC抗菌肽后膜的拉伸強度和斷裂伸長率增大(表6)。根據前期紅外光譜分析表明，隨著抗菌肽的添加，抑菌膜中含有親水性氨基酸殘基和羥基，使其保水性增加。BAGDE 等[11]以玉米淀粉為原料，添加細菌素作為抗菌增強添加劑來制備抗菌膜，結果表明細菌素的加入顯著提高了淀粉膜的拉伸強度和抑菌活性。

表6 抗菌肽對抑菌膜機械性能的影響Table 6 Antimicrobial peptides on mechanical properties of antimicrobial films

2.4 抑菌膜包裝對干酪品質指標的影響

2.4.1 干酪貯藏期間水分含量的變化

干酪貯藏期間，水分損失與貯藏環境的水分相對濕度有關，還與包裝材料對水分的滲透性、包裝的完整性、密封性、貯藏溫度和包裝方式有關[12]。定期分別測定不同包裝干酪的水分含量。由圖1可以看出，2組包裝的干酪在貯藏前期水分含量上升，7 d到達最高，然后開始下降。復合膜處理組水分下降的幅度較抑菌膜組小，有顯著性的差異(P<0.05)。貯藏過程中水分的散失主要是微生物活動所需和水分透過包裝材料蒸發流失引起的[13]。抑菌膜組相對于復合膜組水分下降得較快，說明抑菌膜的隔水性較差。在貯藏15 d時，抑菌膜包裝干酪的水分含量由最初的(55.25±2.59)%降至(32.89±1.64)%，下降了22.36%。因此，在后期試驗中應充分考慮抑菌膜的隔水性能，以防止水分的散失。

圖1 不同膜包裝對干酪水分含量的影響Fig.1 Effect of different film packaging on water content of cheese

2.4.2 干酪貯藏期間色澤的變化

顏色是評價干酪質量的重要參數。L*值反映干酪顏色變化，L*值越大，表示褐變程度越輕，樣品越接近白色[13]。如圖2-a所示，2種膜處理組的L*值都隨著時間的延長而降低，這是因為隨著時間的增加，干酪表面微生物逐漸開始生長繁殖，從而會導致L*的下降[14]。而抑菌膜組下降速度較慢，說明其表面微生物生長較慢。b*值的微小變化是評價干酪沒有發生氧化褐變的良好指標[15]。如圖2-b所示，復合膜處理組的b*值先增大后減小，這可能是由于干酪表面脂肪大量析出。貯藏9 d后，干酪的b*值開始降低，可能是由于干酪表面的霉菌等腐敗菌開始生長。而抑菌膜處理組隨著時間的增加，先降低后緩慢增加。在貯藏第11天時，抑菌膜的b*值高達17.9±0.57，可能是隨著貯藏時間的延長，抗菌肽通過擴散作用與干酪表面接觸或者釋放到干酪中，使其表面呈現黃色。而由于抑菌膜具有較強的抗菌作用，抑制了干酪表面有害微生物的生長，使其后期b*值增加。LU等[16]采用靜電自組裝制備的亞麻籽膠-殼聚糖抑菌膜用于蒙古干酪的保鮮時，干酪的L*值隨著時間的推移而降低，而b*值先降低后增加，這與本研究結果一致。

2.4.3 干酪貯藏期間質構特性的變化

干酪的質地不僅是影響消費者購買的重要參數，而且也反映了其微觀結構[17]。硬度一般反映干酪表面蛋白質網絡結構的穩定性，咀嚼性反映食物被咀嚼到吞咽狀態所需要的能量，咀嚼性用黏聚力、硬度和彈性的乘積表示，為咀嚼固體食物所需的能量，咀嚼性反應干酪對咀嚼的持續抵抗性[18]。由圖3-a可知，在整個貯藏過程中，2組干酪的硬度均有顯著提高(P<0.05)。在貯藏11 d時，抑菌膜組的上升趨勢最為顯著(P<0.05)，說明此時干酪對變形抵抗最大，且其硬度由開始的(1 959.62±294.58) g升高至(4 426.36±272.25) g，由此可知，貯藏后期抑菌膜組的水分流失比較嚴重，使其硬度增加。MAHCENE等[19]研究表明，海藻酸鈉生物膜包裝干酪在貯藏過程中所有處理組干酪的硬度都顯著增加(P<0.05)。

a-L*值；b-b*值圖2 不同膜包裝對干酪L*、b*值的影響Fig.2 Effect of different film packaging on L*, b* value of cheese

隨著貯藏時間的增加，彈性不具有顯著性的差異(圖3-b)，但是在第7天抑菌膜組的彈性顯著增加，這可能是因為貯藏過程中隨著脂肪球的降解，酪蛋白的網狀結構變得寬松，使得干酪的彈性增加[20]。在第13天時，抑菌膜組的彈性有顯著性的差異(P<0.05)，這可能是由于硬度的增加，使其彈性減弱。由圖3-c可知，貯藏過程中2組干酪的咀嚼性呈先升高后降低的趨勢，這是因為隨著成熟期的延長，干酪質地變得堅硬而易碎，使得咀嚼性下降。在貯藏過程中，干酪硬度和咀嚼性的升高可能與其較低的水分含量和緊湊的結構有關[21]。

a-硬度；b-彈性；c-咀嚼性圖3 不同膜包裝對干酪質構特性的影響Fig.3 Effect of different film packaging on texture characteristics of cheese

2.4.4 干酪貯藏期間菌落總數和霉菌、酵母菌總數的變化

隨著貯藏時間的增加，干酪中微生物數量增加趨勢如圖4所示。復合膜處理組干酪的菌落總數和霉菌酵母總數上升速率快，顯著高于抑菌膜組(P<0.05)。在第7天時(圖4-a)，其菌落總數為(5.11±0.05) lg CFU/mL，而抑菌膜組為(3.91±0.03) lg CFU/mL，具有顯著性差異(P<0.05)，由圖4-b可知，在第7天時，抑菌膜組的霉菌酵母菌總數為(3.83±0.02) lg CFU/mL，顯著低于復合膜處理組的(5.13±0.10) lg CFU/mL。且在11 d時抑菌膜組的細菌總數和霉菌酵母總數為(4.36±0.05)、(4.51±0.10) lg CFU/mL，低于第7天時的復合膜組的數值。由此可知，采用抑菌膜包裝干酪能減緩在貯藏期間干酪中菌落總數和霉菌、酵母菌總數的增加。抑菌膜組干酪的菌落總數和霉菌、酵母菌總數在貯藏前、中期不斷升高，之后開始緩慢下降，這可能是由于抗菌肽發揮了良好的抑菌效果，有效地抑制了腐敗菌的生長代謝。曹志軍等[22]研究發現，在殼聚糖復合膜中添加納他霉素和溶菌酶制備的天然抑菌膜對Cheddar干酪具有良好的抗菌保鮮性。SILVA等[23]研究表明，添加具有抑制細菌作用的乳酸菌的海藻酸鹽涂層抑制了干酪貯藏過程中腐敗菌的生長。LIM等[24]在葡萄柚籽提取物與聚己二酸丁二醇酯中添加產細菌素乳酸菌制備包裝膜，發現其可抑制干酪中單增李斯特菌的生長。與這些研究相比，本研究在殼聚糖復合膜中添加乳源抗真菌肽制備的抑菌膜能更有效地抑制干酪中腐敗真菌的生長。

a-菌落總數；b-霉菌、酵母菌總數圖4 不同膜包裝對干酪菌落總數和霉菌、酵母菌總數的影響Fig.4 Effect of different film packaging on total amount of colonies, total amount of molds and yeasts in cheese

3 結論

本研究首先確定了殼聚糖復合膜的最優成膜條件：殼聚糖體積分數1.25%，明膠1.75%，甘油0.3%。然后添加抗菌肽制備了抑菌膜，發現2×MIC的抗菌肽的添加有助于提高抑菌膜的機械性能和抑菌性能。抑菌膜的拉伸強度和斷裂伸長率分別為(81.35±0.48) MPa和(17.87±0.22)%。抑菌試驗表明，抑菌膜對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及白假絲酵母具有良好的抑菌活性，其抑菌效果與復合膜相比具有顯著性差異(P<0.05)。將抑菌膜對干酪進行包膜貯藏試驗，結果發現在貯藏期間，抑菌膜組水分含量下降的較快，說明抑菌膜的隔水性較差，因此，在后期試驗中應充分考慮抑菌膜的隔水性能，以防止干酪中水分蒸發。此外，兩種膜處理的L*值都隨著時間的延長而降低，而抑菌膜處理組的b*值先降低后緩慢增加。兩組膜處理干酪的硬度均隨著時間的增加而顯著增加(P<0.05)，咀嚼性降低。且采用抑菌膜包裝干酪能減緩在貯藏期間干酪中菌落總數和霉菌、酵母菌總數的增加。綜上所述，使用具有生物活性的多糖與抗菌肽制備抑菌膜對再制干酪貯藏期間表面腐敗菌的生長具有抑制作用。目前，將抗菌肽與多糖復配制備的抑菌膜應用于干酪包裝的研究還較少，因此，本研究為進一步開展抑菌膜在食品包裝和保鮮等方面的研究奠定了基礎。