基于超高效液相色譜-離子阱-靜電場軌道阱質譜的代謝組學方法分析枸杞酒發酵前后酚類物質的變化

周婷，田曉菊*，周桂珍，徐佳敏，王志新

1(寧夏大學 食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川，750021)2(寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川，750021)3(寧夏昊王米業集團有限公司，寧夏 銀川，751400)

枸杞(Lyciumbarbarum)為茄目(Solanales)茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)多年生落葉灌木[1]，在我國是重要的藥食兩用資源。相關研究表明，枸杞的功能特性歸功于其高含量的營養素(維生素、礦物質、葉酸和纖維素等)和酚類物質。其中，多酚類物質是植物界中最常見的含量豐富的芳香族次生代謝產物，被稱為人體的“第七類營養素”，人體不能通過自身合成，需從外界食物中獲取[2]，多酚類物質作用于人體的生理功能主要包括抗氧化[3]、抗炎[4]、抗癌[5]、降血脂[6]、降血糖[7]等。

由于品種、加工條件、貯存方式等方面的制約，植物的酚類物質活性容易發生相應的變化。近年來，隨著各類代謝組學方法日趨成熟，依賴代謝組學手段對植物中酚類物質的檢測、鑒定與分析能夠幫助人們建立食品功能活性變化與代謝物之間的關系[8]。例如，WANG等[9]以液相色譜-電噴霧質譜(liquid chromatography-electrospray mass spectrometry, LC-ESI-MS/MS)為檢測手段，利用廣泛靶向代謝組分析了5個柑橘品種中169個類黃酮的代謝產物；ZHAO等[10]采用超高效液相色譜-光電二極管陣列質譜(ultra performance liquid chromatography-diode array detector mass spectrometry, UPLC-DAD-MS)，探索了微波處理、烘烤及煮沸對藍莓中酚類物質的影響；雷嗣超等[11]采用超高效液相色譜-串聯質譜(ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry, UPLC-MS/MS)，利用廣泛靶向代謝技術研究了板栗皮中兒茶素類物質經過模擬消化體系后的組成變化，得出其在消化過程中穩定性較差。上述研究說明了代謝組學技術在植物多酚成分科學研究中的可靠性以及廣闊的前景。

但是，利用代謝組學技術對枸杞酒發酵前后酚類物質變化的研究卻鮮有報道。本研究以寧杞1號枸杞干果為研究材料，采用超高效液相色譜-離子阱-靜電場軌道阱質譜(ultra performance liquid chromatography-linear ion trap quadrupole-Orbitrap-mass-spectrometry，UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)，利用廣泛靶向代謝技術，對枸杞酒發酵前后酚類物質的主要代謝成分及酚類物質的積累做了分析，拓寬了對枸杞及枸杞酒中多酚類成分的基礎研究，為枸杞酒活性機理的研究奠定理論基礎，并為枸杞的深加工利用提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧杞1號枸杞干果，中寧縣吉利寶枸杞制品有限公司；白砂糖，市售；一水檸檬酸(食品級)，濰坊英軒實業有限公司；果膠酶、Txl釀酒活性干酵母，法國LAMOTHE-ABIET公司；甲醇(純度≥99.9%)、甲酸(純度≥98.0%)、乙腈(純度≥99.9%)，天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

LTQ Orbitrap XL Domain35A高分辨液-質聯用儀，Thermo Fisher公司；超純水機，湖南科爾頓水務有限公司；靜音真空高速破壁機，九陽股份有限公司；數字折射計，浙江托普云農科技股份有限公司；PHSJ-3F實驗室PH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；電子恒溫不銹鋼水浴鍋，上海宜昌儀器紗篩廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 枸杞酒釀造工藝

原料揀選→沖洗→復水→打漿→硫殺→酶解→過濾→調整成分→接種酵母→陳釀→灌裝→成品

枸杞汁制備：剔除枸杞中的霉果、爛果，流動水沖洗干凈表面的灰塵，瀝干水分后以1∶7(g∶mL)的料水比加入超純水浸泡6 h，打漿2 min，加入H2SO3使SO2的質量濃度達到60 mg/L，添加40 mg/kg果膠酶，45 ℃恒溫水浴酶解5 h，1、2、4、8層紗布依次過濾，初始糖度為8.4 °Brix，白砂糖調節糖度至20.0 °Brix，一水檸檬酸調節pH至3.2～3.5。

接種酵母：配制質量分數1%～5%的糖溶液，將干酵母以枸杞發酵汁總量0.2 g/L計算用量，加入配制好的糖溶液中，置于25～30 ℃培養箱中30 min后，加入制備好的枸杞汁中。

發酵：將枸杞汁裝入2.5 L發酵罐，置于20 ℃培養箱中發酵，主發酵結束后吸取上清液進行陳釀，15 ℃陳釀90 d。分別在發酵0 d(BF)以及陳釀90 d(AF)取樣，3個生物學重復分別命名為BF-1、BF-2、BF-3和AF-1、AF-2、AF-3，存放于-80 ℃冰箱中。

1.3.2 樣品信息

待測樣本為AF-1、AF-2、AF-2和BF-1、BF-2、BF-3。同時制備質控(quality control, QC)樣本：將BF組及AF組進行等量混合，用于平衡色譜-質譜系統，評價系統穩定性[12]。本研究設置3個生物學重復，每個生物學重復的樣品進行3個技術重復。

1.3.3 多酚的提取

根據焦陽[13]的方法略作改進：取樣品于4 ℃解凍，冷凍干燥后低溫研磨，稱取1 g于15 mL的Eppendorf管中，在不斷通入N2的同時加入10 mL 70%(體積分數)的甲醇溶液。避光超聲波處理30 min，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，將上層清液收集于棕色瓶中，上述操作再進行2次重復，將3次提取液收集混合后，再過0.22 μm有機相濾膜，避光保存于-80 ℃冰箱待測。

1.3.4 色譜分離

色譜柱規格型號：AccucoreTMC18，150 mm×2.1 mm，2.6 μm；流動相：A：乙睛，B：0.1%甲酸-水，洗脫梯度:0～1 min，5%～5% A；1～4 min，5%～10% A；4～10 min，10%～14% A；10～16 min，14%～70% A；16～16.5 min，70%～95% A，16.5～18 min，95%～95% A；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進樣體積2 μL；分析時間20 min。

1.3.5 質譜采集

采用電噴霧電離源，在正離子和負離子模式下采集數據，鞘內氣體流速40 arb，輔助氣體流速10 arb，正、負離子模式下輔助氣體噴射電壓分別為3.50和3.20 kV，噴射電流0.04 μA，毛細管溫度350 ℃，毛細管電壓-30 V，管透鏡-110 V，低碰撞能15 eV，高碰撞能60 eV，設置一級質譜質量掃描范圍100～1 000m/z，二級質譜質量掃描范圍50～1 000m/z。

1.4 統計分析

通過文獻檢索匯總與枸杞相關的酚類物質化學成分，通過HumanMetabolome Database (HMDB)(http://www.hmdb.ca)，Metlin(http://metlin.scripps.edu)，massbank(http://www.massbank.jp/)，mzclound(https://www.mzcloud.org/)等數據庫中進一步匹配注釋獲得各代謝物準確的一級、二級離子信息，根據相關信息自建枸杞酚類物質化學成分質譜數據庫。代謝物的鑒定首先進行一級質譜數據對比(Δppm<10)，然后根據MS/MS模式所得碎片離子在自建庫中進行比對確認。利用XcaliburTM4.0軟件設置儀器方法、編輯序列和色譜、質譜數據處理。利用Omicshare云平臺(https://www.omicshare.com/tools/)、微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)以及Metware Cloud平臺(https://cloud.metware.cn/)進行差異代謝物的相關數據分析。

2 結果與分析

2.1 基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS平臺鑒定枸杞及枸杞酒中酚類化合物

基于樣品處理方法及分析條件，對枸杞酒發酵前后樣品中的酚類物質進行分析。在正、負離子模式下從BF及AF中共檢出55種酚類物質(圖1)。BF中檢出52種酚類物質。按照酚類物質的一級分類，有28種酚酸、15種黃酮、5種酚酰胺衍生物、3種香豆素以及1種芪類。從AF中檢出49種酚類物質,其中包括23種酚酸、16種黃酮、6種酚酰胺衍生物、3種香豆素以及1種芪類。BF與AF共同檢出的物質有46種，相關內容見電子版增強出版附件(http://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.030506)，其中有22種酚酸、15種黃酮、5種酚酰胺衍生物、3種香豆素以及1種芪類。BF中檢出而AF未檢出物質有6種，皆為酚酸類物質，分別是4-甲氧基肉桂酸、對香豆酸甲酯、6-O-咖啡酰-D-葡萄糖、酪醇、1-O-肉桂酰-β-D-葡萄糖、阿魏酰咖啡酰酒石酸；AF中檢出而BF未檢出物質有3種，1種酚酰胺衍生物、1種黃酮、1種酚酸，分別為N-N-二(二羥基咖啡酰)亞精胺、3′,4,4′,5,7-五羥基黃烷、4-氨基水楊酸。

發酵前有5種酚酸類物質為結合態酚酸，相關研究表明，在發酵體系中，隨著微生物的作用，產生的酶類可將結合態酚酸分解為游離態酚酸[14]，這5種結合態酚酸或將分解為肉桂酸、對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等游離態酚酸，從而提高枸杞酒中酚酸類物質的抗氧化活性及生物利用度。

圖1 實驗組樣品的酚類物質韋恩圖Fig.1 Venn diagram of phenolic substances in different groups

2.2 酚類化合物主成分分析(principal components analysis,PCA)

PCA得分圖的聚散程度反映了樣本代謝物的相近程度，即反映了枸杞酒發酵前后酚類代謝物的聚集情況，在代謝水平上差異越大的樣品在得分圖上間距越大[15]。由圖2可知，QC樣本聚集性好，說明檢測過程儀器穩定性好、信號較為穩定，具有良好的實驗重現性。實驗組BF及AF在PCA空間緊密聚集，同時，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的解釋率分別為99.16%和0.54%，兩者累計貢獻率達99.70%，可見各實驗組樣本之間分離效果較好，代謝物數據結果可靠，BF及AF組間存在顯著差異。BF與AF組分離明顯，這表明樣品經過發酵處理后，樣品中的酚類代謝物發生了明顯的改變。

圖2 QC組和實驗組樣品PCA得分圖Fig.2 PCA scoring plot of QC and experimental samples

2.3 酚類化合物正交偏最小二乘法分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)

OPLS-DA相對于偏最小二乘法分析，能夠有效剔除與研究無關的影響，從而篩選出差異代謝物，為準確獲得組間及組內酚類物質的差異狀況，本研究又采用OPLS-DA有監督的判別方法對發酵前后的酚類物質進行分析。OPLS-DA得分圖及置換檢驗圖結果(圖3)與PCA結果大體一致，可以看出BF與AF組發生了明顯的分離。

a-模型得分圖；b-置換檢驗圖圖3 實驗組OPLS-DA得分圖及OPLS-DA置換檢驗圖Fig.3 OPLS-DA model and OPLS-DA permutation test of different groups

2.4 酚類差異代謝物的篩選與分析

從共同可檢的46種酚類物質中，依據T檢驗，取P<0.05，差異倍數(fold change,FC)>2且FC<0.5，篩選出28種物質，如圖4。再以OPLS-DA模型中變量的權重值(variable important in projection,VIP)>1為條件，篩選出的差異代謝物13種，如表1所示。

圖4 酚類差異代謝物火山圖Fig.4 Volcanic map of phenolic substances

由表1可見，在BF與AF組的對比中，篩選出差異代謝物共13種，其中包括酚酸、黃酮、酚酰胺衍生物以及香豆素，分別占比為57.14%、14.29%、14.29%以及7.14%。差異代謝物中，酚酸類物質占比最大，且豐度高。篩選出的13種差異代謝物中，有5種物質上調，分別是對香豆酸-4-O-葡萄糖苷、6-O-阿魏酰-D-葡萄糖、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、N-N-二(二羥基咖啡酸)亞精胺己糖苷以及異莨菪亭。8種物質下調，依次是1-萘酚、二氫阿魏酸、綠原酸、對香豆酸-4-O-二己糖苷、2,5-二羥基苯甲醛、α-羥基肉桂酸、苜蓿素-5-O-葡萄糖苷、(二氫咖啡酰)咖啡酰亞精胺。

表1 枸杞酒發酵前后酚類差異代謝物Table 1 Phenolic substances of L. barbarum wine before and after the fermentation

VIP>1.5的物質，從大到小排序依次為6-O-阿魏酰-D-葡萄糖、N-N-二(二羥基咖啡酸)亞精胺己糖苷、異莨菪亭、二氫阿魏酸、(二氫咖啡酰)咖啡酰亞精胺、對香豆酸-4-O-二己糖苷。這6種物質中，6-O-阿魏酰-D-葡萄糖對整個模型的貢獻率最大，其他物質則依次遞減。

為了直觀觀察發酵前后酚類差異代謝物的濃度變化趨勢，依據每個差異代謝物的相對含量做出熱圖，如圖5所示，熱圖的顏色代表了代謝物在該組樣本中相對表達量的大小，顏色由綠到黃再到紅代表著代謝物豐度逐漸升高，高低表達交互存在，紅色為高表達組分，綠色為低表達組分。依據2組樣品進行聚類，可將圖5分成2個區域，發酵前樣品為第一區域，發酵后的枸杞酒為第二區域。

酚酸具有良好的生物學活性，枸杞中酚酸類化合物，如咖啡酸和綠原酸，可抗病毒、抗腫瘤、抗氧化，阿魏酸有消炎、抗血栓的作用[16]；所篩選的差異代謝物中酚酸類物質顯著上調的有對香豆酸-4-O-葡萄糖苷、6-O-阿魏酰-D-葡萄糖，顯著下調的有1-萘酚、二氫阿魏酸、綠原酸、對香豆酸-4-O-二己糖苷、2,5-二羥基苯甲醛、α-羥基肉桂酸。在枸杞酒發酵過程中酚酸類物質大多呈下調趨勢，相關研究表明，一些酵母或細菌可將酚酸類物質脫羧為乙烯基酚，導致酚酸類物質含量下降[17]。其中，對香豆酸-4-O-二己糖苷下調的同時，對香豆酸-4-O-葡萄糖苷上調，推測其側鏈二糖基團在發酵過程中分解為單糖基團。

圖5 酚類差異代謝物聚類熱圖Fig.5 Cluster heat map of phenolic substances

黃酮類物質也廣泛存在于自然界的漿果中，枸杞黃酮是眾多生理實驗中發揮抗氧化、抗衰老、治療心腦血管疾病等藥理活性的主要物質基礎，不僅可以抗輻射、抗疲勞、促進免疫力，還能減緩細胞的退化，預防癌癥的發生[18-21]。所篩選的差異代謝物中酚酸類物質呈顯著上調的是槲皮素-3-O-蕓香糖苷(蘆丁)。蘆丁是一種良好的抗氧化劑，其苷元槲皮素，與綠原酸、山奈酚、異鼠李素是枸杞果實中具有較高抗氧化活性的物質[22]，枸杞酒中的蘆丁含量增加可能是由于枸杞果實中的前體物質在發酵過程中合成。有研究表明，由于黃酮類物質龐大的糖苷基團，使得其位阻效應起首要作用，削弱或阻礙了苯環3、4位的—OH的作用，使得其抗氧化性降低，但蘆丁的糖苷化卻對抗氧化性無顯著影響[23]，故枸杞酒發酵過程蘆丁含量增加，或將增加枸杞酒的抗氧化活性；苜蓿素-5-O-葡萄糖苷則呈顯著下調，可能是酵母中的β-葡萄糖苷酶使葡萄糖苷部分水解導致。

枸杞中的酚酰胺衍生物除具有抗菌、抗病毒、抗癌等藥理作用外，還可通過激活Nrf2/HO-1途徑來預防腦I/R損傷，改善氧化損傷和神經細胞凋亡[24]。在表1的代謝物中，N，N-二(二羥基咖啡酸)亞精胺己糖苷呈顯著上調，VIP值為2.39，大于呈下調的(二氫咖啡酰)咖啡酰亞精胺，表明其對模型的貢獻率較大。(二氫咖啡酰)咖啡酰亞精胺下調伴隨著N，N-二(二羥基咖啡酸)亞精胺己糖苷上調，推測二者是前體與產物的關系。另外，有研究報道，酚酰胺衍生物為枸杞果實中苦味物質的重要來源[25-26]，或將與枸杞酒中苦味有關，這些都有待進一步研究。

部分香豆素具有抗炎、鎮痛以及降低尿酸的作用，枸杞中抑制血管緊張素轉化酶活性的主要物質可能為香豆素類化合物[27-29]。實驗檢測出的異莨菪亭顯著上調，或將更加豐富枸杞酒的生理功能。

3 結論

本研究基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術，結合自建枸杞酚類物質數據庫，鑒定出寧杞1號枸杞中含有酚酸、黃酮、酚酰胺衍生物、香豆素、芪類等5大類物質中的55種酚類物質，通過PCA和OPLS-DA，從代謝組學層面系統分析了寧杞1號枸杞在發酵前后酚類物質的差異。共篩選出13種差異代謝物，通過顯著變化的酚類物質分析表明，枸杞發酵過程中，酚類物質的各類變化將賦予枸杞酒更顯著的生理活性及風味特征，研究結果為探索酒精發酵對酚類物質的影響及代謝機制提供參考。