超聲波輔助復合酶法提取核桃青皮總黃酮工藝研究

張潤紅　謝簡珺　趙　麗

超聲波輔助復合酶法提取核桃青皮總黃酮工藝研究

張潤紅謝簡珺趙麗

（蘭州石化職業技術大學甘肅蘭州730000）

為尋求一種以水為溶劑高效提取核桃青皮總黃酮的最優工藝，以便后續核桃青皮堆肥歸田還林，實驗采用超聲波輔助復合酶提取核桃青皮總黃酮進行研究。首先通過單因素實驗分析了復合酶配比、浸取溫度、料液比、浸取時間和浸取液pH等因素對核桃青皮總黃酮提取率的影響，然后利用響應面分析法優化提取工藝條件，最后通過三組平行實驗驗證優化結果。實驗表明：在功率為100 W的超聲環境中，當復合酶配比（果膠酶/纖維素酶）為1∶1，浸取溫度為55 ℃，液料比（g/mL）為1∶35，浸取時間為30 min，浸取液pH為6時，總黃酮提取率最高，約為7.53％。

核桃青皮；超聲波；復合酶；總黃酮；提取工藝

核桃青皮又稱青龍衣，為核桃外部一層厚厚的綠色果皮，是核桃最主要的副產品。在核桃加工場所，會產生2倍以上干核桃的核桃青皮，數量較大。充分利用核桃青皮資源不但可以成為核桃產業新的經濟增長點，還可以減少由于核桃青皮不合理處置產生的環境污染。目前，最理想的核桃青皮利用方式是先提取核桃青皮中的單寧、黃酮類、多酚類和萘醌等活性物質，然后將核桃青皮堆肥歸田還林[1-3]。

黃酮類化合物是核桃青皮的次生代謝產物之一，具有抗氧化、抑菌、防止血管增生、抗病毒、降血糖、降血脂、抗骨質疏松、預防老年癡呆和腦出血等多種作用，利用價值較高[4-5]。本實驗同時利用超聲波產生的振蕩力和高速、劇烈的空化效應以及生物酶解技術的破壁作用，加速細胞內成分的溶解、擴散，從而提取核桃青皮總黃酮[6]。首先考察復合酶配比、料液比、浸取溫度、浸取液pH、浸取時間等單因素對總黃酮提取率的影響，然后選取對實驗影響較大的三個因素進行響應面法優化分析，最終確定出最優提取工藝，為提取核桃青皮總黃酮提供科學依據。

1 超聲波輔助復合酶法提取核桃青皮總黃酮實驗

1.1 材料與儀器

核桃青皮，產于甘肅慶陽；蘆丁標準品（純度98％）、果膠酶（酶活力500 U/mg）、纖維素酶（酶活力50 U/mg），均購于上海源葉生物科技有限公司；NaOH、無水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3，均為分析純試劑。

AB-204-N型分析天平，瑞士Mettler公司；PHS-4C+酸度計，成都世紀方舟科技有限公司；H1850型臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；KQ2200DB超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1801型紫外/可見分光光度計，北京北分瑞利分析儀器（集團）有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 核桃青皮的預處理

將新鮮的核桃青皮洗凈后曬干[7]，去除雜質，粉碎，過40目篩，室溫下儲存于干燥器中備用。

1.2.2 蘆丁標準曲線的建立

準確稱取干燥至恒重的蘆丁標準品6 mg，用80％的乙醇溶液溶解后定容至100 mL容量瓶，搖勻，即得質量濃度為0.06 g/L的蘆丁標準儲備液。準確移取蘆丁標準儲備液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，依次加入2.0 mL 5％的NaNO2溶液，搖勻靜置6 min，再加入2.0 mL 10％的Al(NO3)3溶液，靜置6 min，再加入20.0 mL 5％的NaOH溶液，用80％的乙醇溶液定容，混勻顯色15 min，最后使用1 cm比色皿于510 nm處測定溶液的吸光值A。以溶液的吸光值A對蘆丁的質量濃度作圖，繪制蘆丁標準曲線，擬合回歸方程[8-10]。

1.2.3 總黃酮的提取及含量測定

準確稱取核桃青皮粉末1.0 g、復合酶（纖維素酶＋果膠酶）0.04 g于100 mL圓底燒瓶中，置于功率為100 W的超聲環境中分別在不同的復合酶配比、料液比、浸取溫度、浸取液pH、浸取時間條件下用水浸取核桃青皮總黃酮，待浸取液冷卻至室溫后轉移至100 mL容量瓶中定容備用。取一定量浸取液至離心杯中，在8 000 r/min的轉速下離心10 min，取上清液3 mL于50 mL容量瓶中，依次加入2.0 mL 5％的NaNO2溶液，搖勻靜置6 min，再加入2.0 mL 10％的Al(NO3)3溶液，靜置6 min，再加入20.0 mL 5％的NaOH溶液，用水定容，混勻顯色15 min，最后使用1 cm比色皿于510 nm處測定溶液的吸光值，以蘆丁標準曲線作為參照，計算核桃青皮總黃酮含量，并按如式（1）求出總黃酮的提取率。

式（1）中：為浸取液中總黃酮質量濃度（mg/mL）；為浸取液體積（mL）；為浸取液稀釋倍數；為稱取的核桃青皮粉末的質量（g）；為總黃酮提取率（％）。

1.2.4 單因素實驗設計

（1）復合酶配比對總黃酮提取率的影響

在浸取溫度為50 ℃，浸取時間為50 min，料液比（g/mL）為1∶30，浸取液pH為5.0，復合酶配比（果膠酶/纖維素酶）分別為0∶0、1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1的條件下，考察復合酶配比（果膠酶/纖維素酶）對總黃酮提取率的影響。

（2）浸取溫度對總黃酮提取率的影響

在復合酶配比（果膠酶/纖維素酶）為1∶1，浸取時間為50 min，料液比（g/mL）為1∶30，浸取液pH為5.0，浸取溫度分別為35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃的條件下，考察浸取溫度對總黃酮提取率的影響。

（3）浸取時間對總黃酮提取率的影響

在復合酶配比（果膠酶/纖維素酶）為1∶1，浸取溫度為50 ℃，料液比（g/mL）為1∶30，浸取液pH為5.0，浸取時間分別為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min的條件下，考察浸取時間對總黃酮提取率的影響。

（4）料液比對總黃酮提取率的影響

在復合酶配比（果膠酶/纖維素酶）為1∶1，浸取溫度為50 ℃，浸取液pH為5.0，浸取時間為50 min，料液比（g/mL）分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40的條件下，考察料液比（g/mL）對總黃酮提取率的影響。

（5）浸取液pH對總黃酮提取率的影響

在復合酶配比（果膠酶/纖維素酶）為1∶1，浸取溫度為50 ℃，料液比（g/mL）為1∶30，浸取時間為50 min，浸取液pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的條件下，考察浸取液pH對總黃酮提取率的影響。

2 總黃酮提取實驗結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

如圖1所示，以吸光度為因變量，蘆丁質量濃度（mg/mL）為自變量，得到線性回歸方程為=11.589－7×10-6，相關系數2=1，蘆丁標準曲線線性關系良好。

圖1　蘆丁標準曲線

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 復合酶配比的影響結果

不同復合酶配比下的總黃酮提取率如圖2所示，可知在其他條件不變時，加入復合酶后核桃青皮總黃酮提取率顯著提高，說明加入復合酶有助于總黃酮的溶出。其中，當復合酶配比（果膠酶/纖維素酶）為1∶1時，總黃酮提取率達到最大，這可能與核桃青皮的細胞壁組成和纖維素酶、果膠酶的酶活力不同有關。

圖2　不同復合酶配比下的核桃青皮總黃酮提取率

2.2.2 浸取溫度的影響結果

不同浸取溫度下的核桃青皮總黃酮提取率如圖3所示，可知在其他條件一定時，總黃酮提取率隨著浸取溫度的升高呈現先升后降的趨勢，在55 ℃時達到峰值。原因可能是，隨著溫度的升高，復合酶的活性逐漸增強，在55 ℃時活性最強，而當溫度超過55 ℃后復合酶逐漸失活，導致總黃酮提取率降低[11-12]。

圖3　不同浸取溫度下的核桃青皮總黃酮提取率

2.2.3 浸取時間的影響結果

不同浸取時間下的核桃青皮總黃酮提取率如圖4所示，可知在其他條件一定時，總黃酮提取率隨浸取時間的增加整體呈先升后降的趨勢，當浸取時間為30 min時，總黃酮提取率達到最大值。原因可能是，隨著時間的延長，超聲波的空化、振蕩作用和復合酶的破壁作用結合，不僅使核桃青皮組織細胞破碎程度增加，也使黃酮類物質的損失增加，從而降低了總黃酮的提取率。

圖4　不同浸取時間下的核桃青皮總黃酮提取率

2.2.4 料液比的影響結果

不同料液比下的核桃青皮總黃酮提取率如圖5所示，可知在其他條件一定時，核桃青皮總黃酮的提取率隨液料比（g/mL）的增加呈先升后降的趨勢，在液料比（g/mL）為1∶35時達到最大值。可能原因是，浸取液較少時，核桃青皮粉末與浸取液的接觸面有限，總黃酮溶出效果欠佳。隨著溶劑量的增加，核桃青皮粉末與浸取液的接觸面積增大，浸取更充分，進而核桃青皮總黃酮溶出率升高。當料液比（g/mL）超過1∶35，繼續增加浸取液的量對總黃酮的溶出發揮作用開始受限，而與黃酮類物質存在拮抗作用的色素等其他雜質的溶出率開始上升，反而影響了總黃酮的提取效果[13]。

圖5　不同料液比下的核桃青皮總黃酮提取率

2.2.5 浸取液pH的影響結果

不同浸取液pH下的核桃青皮總黃酮提取率如圖6所示，可知在其他條件一定時，浸取液pH對總黃酮提取率的影響波動較大，其中在pH=6.0時，總黃酮提取率達到最大值。其主要原因是，復合酶由果膠酶和纖維素酶兩種酶組成，而這兩種酶的最適pH不一致，所以在不同的pH條件下各自發揮的作用存在差異。當pH=6.0時，兩種酶的協同作用最強。當pH超過6.0時，復合酶開始出現失活，致使總黃酮提取率開始下降。

圖6　不同浸取液pH下的核桃青皮總黃酮提取率

3 響應面法優化工藝實驗

3.1 響應面法實驗因素設計

根據單因素實驗結果，選取對核桃青皮總黃酮提取率影響較大的三個因素為自變量，即浸取溫度、浸取時間、浸取液pH，以核桃青皮總黃酮提取率為因變量，進行三因素三水平Box-Behnken響應面法實驗設計，如表1所示。

表1　響應面實驗因素水平和編碼

3.2 響應面實驗結果及分析

3.2.1 響應面實驗分組設計及結果

浸取溫度、浸取時間、浸取液pH的三因素三水平Box-Behnken響應面法分析實驗設計及提取率結果如表2所示。

表2　響應面實驗分組設計與結果

3.2.2 建立響應面模型擬合及方差分析

以浸取溫度、浸取時間、浸取液pH為考察因素，以總黃酮提取率為評價指標，使用Design-Expert10.0.1軟件對實驗數據進行統計分析，得到二次多項式回歸方程如下：

=7.498+0.0425-0.055-0.0425+0.0525+0.0375+0.0575-0.595252-0.520252-0.585252（2）

對回歸方程進行方差分析，結果如表3所示。浸取溫度、浸取時間、浸取液pH三個因素對總黃酮提取率影響均顯著，其中浸取時間對總黃酮提取率影響最顯著。該模型＜0.000 1，說明此模型差異具有統計學意義，而且實驗模型與真實數據擬合程度良好，可用于分析和預測核桃青皮總黃酮提取率最優提取工藝。

表3　響應面擬合回歸方程的方差分析結果

續表3響應面擬合回歸方程的方差分析結果

注：2=0.996 7，Adj2=0.992 4，Pred2=0.965 4。

3.2.3 響應曲面分析

不同因素間的交互作用對總黃酮提取率的影響見圖7至圖9。

由圖7可見，浸取溫度和浸取時間交互作用下的總黃酮提取率呈拋物面分布，當浸取溫度不變時，總黃酮提取率隨浸取時間的延長呈先升后降趨勢；當浸取時間一定時，總黃酮提取率隨浸取溫度的升高也呈先升后降趨勢；由曲面波動幅度可見浸取時間較浸取溫度對總黃酮提取率的影響更為顯著。可得到兩因素的最優工藝組合在浸取溫度54 ℃～57 ℃、浸取時間28 min～32 min。

由圖8可見，浸取液pH和浸取溫度的交互作用等高線呈近圓形，表明二者的交互作用對總黃酮提取率影響不顯著。總黃酮提取率隨浸取液pH和浸取溫度的增加呈現先增后減變化，當浸取溫度為54 ℃～57 ℃，浸取液pH取5.9～6.1水平區間值時，總黃酮提取率最高。

由圖9可見，浸取時間與浸取液pH交互作用曲面圖縱向跨度較大，值小于0.05，表明二者交互作用對總黃酮提取率影響顯著。當浸取時間在28 min～32 min水平區間，浸取液pH在5.9～6.1時，總黃酮提取率最高。

圖7　浸取溫度和浸取時間的交互作用對總黃酮提取率的影響

圖8　浸取溫度和浸取液pH的交互作用對總黃酮提取率的影響

最后，綜合回歸方程的方差分析結果和響應曲面分析結果，采用Design-Expert 10.0.1軟件進行分析，得到超聲波輔助復合酶法提取核桃青皮總黃酮的最優工藝：浸取溫度為55.16 ℃，浸取時間為29.465 min，浸取液pH為5.981，預測總黃酮提取率為7.501％。

3.3 驗證實驗結果

根據軟件預測結果，考慮到操作的可行性，最后確定的最優工藝參數如下：浸取溫度為55 ℃，浸取時間為30 min，浸取液pH為6。在此工藝條件下進行三組平行實驗，得到總黃酮提取率平均值為7.53％，與預測值7.501％接近，表明響應面法優化超聲波輔助復合酶法提取核桃青皮總黃酮工藝的方法有效可行。

4 結論

本文通過單因素實驗和響應曲面分析法確定了超聲波輔助復合酶法提取核桃青皮總黃酮的最優工藝，工藝參數分別為復合酶配比（果膠酶/纖維素酶）為1∶1，浸取溫度為55 ℃，液料比（g/mL）為1∶35，浸取時間為30 min，浸取pH為6。該工藝條件下三組平行實驗的總黃酮提取率平均值為7.53％。

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Study on the Extraction of Total Flavonoids from Walnut Green Husk by Ultrasonic-assisted Compound Enzyme Method

Zhang RunhongXie JianjunZhao Li

（Lanzhou Petrochemical University of Vocational Technology, Lanzhou, Gansu, 730000）

In order to find an optimal technology of extracting total flavonoids from walnut green husk efficiently with water as solvent, so as to return walnut green husk compost to farmland and forest, the extraction of total flavonoids from walnut green husk by ultrasonic-assisted compound enzyme method was studied in this experiment. Firstly, the influence of factors such as compound enzyme ratio, extraction temperature, material liquid ratio, extraction time and pH of extraction solution on the extraction rate of total flavonoids from walnut green husk was analyzed by single factor experiment. Then, the extraction process conditions were optimized by response surface analysis. Finally, the optimization results were verified by three groups of parallel experiments. The results showed that in the ultrasonic environment with power of 100 W, when the ratio of compound enzyme (pectinase/cellulase) was 1:1, the extraction temperature was 55 ℃, the ratio of liquid to material (g/mL) was 1:35, the extraction time was 30 min, and the pH of the extraction solution was 6, the extraction rate of total flavonoids was the highest, about 7.53%.

Walnut Green Husk;Ultrasonic; Compound Enzyme; Total Flavonoids; Extraction Process

10.3969/j.issn.2095-1205.2022.10.15

TQ914

A

2095-1205(2022)10-49-06

蘭州石化職業技術大學2021年度教科研項目（KJ2021- 12）

張潤紅（1987- ），女，甘肅慶城人，本科，講師，研究方向為化工教學與天然藥物有效成分分離。