NLRP3炎癥小體在熱應激損傷中的作用研究

楊麗麗 李 斌 倪海東

（南通大學附屬醫院兒科 南通 226001）

小兒熱性驚厥（Febrile Seizures，FS）主要是因為發熱所引起的，對于6個月-5歲的幼兒有著較高的發病率[1]。尤其是在我國的南方地區，發病率達到了16%。關于FS的發病機制，主要是由于異常過度放電引起[2]，所以是難以進行預測的，主要的診斷手段為影像學、腦電波記錄、腰椎穿刺等等，這些都是屬于有創診斷，會對患兒的身體造成較大傷害。由于缺少FS治療手段，所以在臨床上往往是通過藥物緩解癥狀，但是具有一定的副作用[3]。炎癥小體是胞漿當中的多蛋白復合物，可以對受體進行識別以及危險信號傳導，激活下游級聯反應。相關研究表明，NLRP3炎癥小體在很多疾病當中都會產生炎癥反應[4]。本文基于此，對NLRP3炎癥小體在熱應激損傷中的作用進行了研究。研究報告如下。

1 材料與方法

1.1 設備

生物超凈臺DMEM培養基（美國Hcyclone），胎牛血清（美國GIBCO），青鏈霉素（美國GIBCO），MTT（美國GIBCO），DMSO（美國Sigma公司），蘇木精-伊紅染液（上海舜田生物有限公司）[5]。

1.2 方法

選擇2019年5月1日-2021年11月1日在南通大學附屬醫院就診的90例6月-6歲FS患兒作為熱性驚厥組(FS組)，其中單純性熱性驚厥患兒（SPS）52例，復雜性熱性驚厥患兒（CFS）38例。選擇同一時期到我院進行健康體檢的25例健康兒童作為對照組。通過PCR的方法對外周血NLRP3、ASC和Caspase-1mRNA的表達進行檢測，通過ELISA法檢測患者外周血IL-1β、IL-6， TNF-α、NSE表達水平進行檢測。納入標準：FS診斷標準:根據第八版《諸福棠實用兒科學》，并最終確診原發病為急性上呼吸道感染[6]。CFS入選標準:長時間的驚厥發作，持續時間≥15min；叢集式發作，24h內反復發作≥2次；局灶性發作，且熱退1周后有腦電圖異常；反復頻繁的驚厥發作，累計發作總次數≥5次。具備上述1條即可診斷為CFS。排除標準：1)有原發性的顱腦損傷患兒；2)有顱內感染的患兒；3)CT/MRI檢查有異常的患兒；4)確診癲癇的患兒；5)維生素D缺乏低Ca性抽搐；6)其他電解質紊亂引起的抽搐；7)代謝性疾病引起的抽搐；8)出生為早產兒或過期產兒[7]。

建立FS動物模型，選擇20只SPF級別周齡2周的正常SD大鼠作為研究對象，通過熱水浴誘導驚厥的方式進行建模，FS5級行為評分標準進行評分。共分為五級，癥狀從輕到重[8]。使用RIPA裂解液對蛋白進行裂解，溫度為4℃，在12000g下離心15min，靜置10min后取上清液，按照每孔30ug進行蛋白分離。最后，為了探討NLRP3炎癥小體抑制劑在反復FS當中的保護作用，將大鼠分為FS組（n=10）、FS+NLRP3炎癥小體抑制劑組（n=10），在熱水浴槽當中進行誘導，觀察驚厥行為的特征，若出現跌倒或者痙攣，將其當做第一次的驚厥發作，并講放入熱水浴槽到驚厥發作的時間進行記錄，發作驚厥后放入常溫平板中進行休息，休息時間5min，隨后重新放入熱水浴槽，若再次出現驚厥行為，將其當做第二個發作。實驗時長為55min，若沒有發生驚厥性為，則當做未出現驚厥發作。誘發驚厥 2次/d，共 10次。比較兩組潛時。

2 結果

2.1 兩組患兒外周血相關數據變化

將兩組患兒的外周血相關數據變化進行記錄。研究結果表明，FS組患兒的IL-1β、IL-6、NLRP3、TNF-α明顯升高，且相較于正常對照組，具有統計學差異（P＜0.05）。具體數據如表1所示。

表1 兩組患兒外周血相關數據變化

2.2 大鼠模型實驗結果

將大鼠分為FS組和FS+NLRP3炎癥小體抑制劑組，對大鼠進行熱水浴模型測試，觀察兩組大鼠的驚厥發作潛時。研究結果表明，FS組大鼠的潛時明顯低于FS+NLRP3炎癥小體抑制劑組，且在數據的對比中具有統計學差異（P＜0.05），如表2所示。

表2 兩組大鼠驚厥行為潛時對比

2.3 兩組大鼠在不同時間的生存率比較

將兩組大鼠在不用時間內的生存率進行比較，研究結果表明，1小時內，兩組大鼠的生存率無明顯差異（P＞0.05），在2小時后，兩組大鼠的生存率具有明顯差異，在平均生存時間上也具有統計學差異（P＜0.05）。具體數據如表3所示。

表3 兩組大鼠在不同時間的生存率比較（%）

3 討論

當前關于熱應激損傷的發病機制還不是很完善，這與兒童神經系統的發育功能有著密切的關系，由于神經系統的發育功能不完全，導致神經元的微環境受到了影響[9]。相關研究表明，FS的發生與呼吸性堿中毒有關，隨著患兒體溫的升高，會導致機體通氣過度，提高二氧化碳的濃度，直接引起呼吸性堿中毒[10]。由于高熱所引起的炎癥對幼兒的生活質量造成了較大的影響，高熱相關的因子包括白介素-1β（IL-1β）、白介素-1α（IL-1α）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）等[11]，這些因子的表達在熱驚厥患者中都有明顯的提高。在某項大鼠模型研究中，缺乏IL-1β受體的大鼠更加耐受熱驚厥，說明IL-1β參與到驚厥的發生中。隨后對周齡為2周的大鼠注射紅藻氨酸[12]，從而建立熱驚厥模型，結果表明IL-1β在熱性驚厥中有潛在的發生作用。NLRP3炎癥小體是由NLRP3、ASC、pro-caspase-1所組成[13]，是一種多聚體的蛋白復合物。在受到高熱的刺激之后，炎癥因子會啟動[14]。細胞受到高熱影響時，細胞當中的識別受體PRRs（Pattern Recognition Receptors）會與結合分子ASC、NLRP3、caspase-1組成完整的炎癥小體。NLRP3炎性小體能使磷酸化caspase-1去磷酸化，活化的caspase-1促進 IL-1β、白介素-18 ( IL-18) 炎性因子前體的成熟，由此可見 NLRP3 炎性小體活化是IL-1β成熟的關鍵。盡管臨床研究及動物實驗均證實IL-1β在熱性驚厥中表達上調，但是目前國內外尚沒有關于NLRP3炎癥小體與小兒熱性驚厥的發作關系研究的報道[15]。

本文基于此，對NLRP3炎癥小體在熱應激損傷中的作用展開了研究。研究結果表明，熱性驚厥組患兒，尤其是復雜性熱性驚厥患兒（CFS）的IL-1β、IL-6、NLRP3、TNF-α有明顯的升高，相較于正常對照組具有統計學差異。在大鼠模型的研究中，FS組大鼠驚厥潛時明顯低于FS+NLRP3炎癥小體抑制劑組，表明有了抑制劑的加成，大鼠的驚厥潛時增加，驚厥次數較少。在不同時間內大鼠生存率的比較中，1小時內兩組大鼠的生存率無明顯統計學差異，在兩小時后，FS+NLRP3炎癥小體抑制劑組的大鼠潛時明顯高于FS組，且在平均生存時間上高于FS組，具有統計學差異。

綜上所述，NLRP3炎癥小體會參與到熱應激損傷中，會對NLRP3炎癥小體進行抑制，并且提高大鼠的生存時間。可提高患兒的IL-1β、IL-6、NLRP3、TNF-α等相關指標，增加大鼠模型的驚厥潛時，且NLRP3炎癥小體的激活與IL-1β有著密切的關系。是熱應激損傷中非常重要的指標之一，需要重視。