罕見IVS Ⅱ-705(T>G) β-地中海貧血基因攜帶者2例報道并文獻復習*

黃心怡,林 靖

1.成都中醫藥大學醫學與生命科學學院，四川成都 611137；2.貴州省人民醫院輸血科，貴州貴陽 550002

β-地中海貧血(簡稱β-地貧)是我國南方地區常見的一種遺傳性溶血性貧血病，臨床表現為小細胞低色素性貧血。β-地貧是由于β-珠蛋白(HBB)基因突變導致β-珠蛋白肽鏈缺如(β0)或合成不足(β+)引起的常染色體隱性遺傳病[1-2]。到目前為止，在人類血紅蛋白(Hb)變異和地中海貧血數據庫(HbVar：https://globin.bx.psu.edu/)中收錄的β-地貧突變類型有300多種。不同地域和人群之間的β-地貧基因突變譜存在較大差異。目前在中國人群中已發現129種HBB基因點突變(含異常Hb)和16種β-地貧缺失突變。其中8種突變(c.124_127delTTCT、c.52A>T、c.316-197C>T、c.-78A>G、c.216_217insA、c.79G>A、c.92+1G>T、c.-79A>G)占中國人β-地貧突變總體的95%以上[3]。隨著測序技術在臨床上的廣泛運用，一些罕見突變類型也不斷被發現，為臨床遺傳咨詢和產前診斷提供了更多的依據[4-5]。本研究發現了2例罕見IVS Ⅱ-705(T>G) β-地貧攜帶者，現對其臨床表型及基因型進行分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 2例患兒之間無血緣關系，患兒1為女性，年齡10個月；患兒2為男性，2歲。患兒在貴州省人民醫院血常規檢測時發現有小細胞低色素貧血表現，Hb電泳發現HbA2升高，需進一步做β-地貧基因檢測。經家屬知情同意后抽取乙二胺四乙酸二鉀抗凝外周靜脈血2 mL。

1.2主要儀器與試劑 Sysmex XN-9000全自動血細胞分析儀及配套試劑；法國Sebia毛細管電泳儀及配套試劑；天隆NP968核酸自動提取儀，E-Cycler TM 96 PCR擴增儀；β-地貧基因突變檢測試劑盒由凱普生物科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1血液學檢測 在儀器最佳狀態下檢測標本，嚴格按照操作程序檢測紅細胞計數(RBC)、Hb水平、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞體積分布寬度的標準差(RDW-SD)等紅細胞參數。采用Sebia毛細管電泳儀檢測HbA、HbA2、HbF等Hb成分的相對水平。

1.3.2β-地貧基因檢測 采用PCR結合反向點雜交(RBD-PCR)技術[6]，檢測17種HBB基因點突變，依次為CD41-42(-TCTT)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、CD17(A>T)、-28(A>G)、CD26(G>A)、CD71-72(+A)、CD43(G>T)、-29(A>G)、Int(T>G)、CD14-15(+G)、CD27-28(+C)、-32(C>A)、-30(T>C)、IVS-Ⅰ-1(G>T)、IVS-Ⅰ-5(G>C)、CD31(-C)、CAP +40-+43(-AAAC)。對罕見β-地貧基因突變類型，應用PCR技術擴增HBB基因全長，引物序列為F：5′-ACGGCTGTCATCACTTAGAC-3′，R：5′-CTCCCACATTCCCTTTTTAG-3′。擴增產物送至上海生物工程有限公司進行雙向測序，測序結果與GeneBank上的HBB基因參考序列進行比對分析測，查找是否存在其他罕見突變類型。

2 結 果

2.1血液學檢測結果 2例患兒的血液學檢測結果均為輕度小細胞低色素貧血，MCV、MCH降低，血紅蛋白電泳HbA2水平升高，HbF水平輕度升高，提示為輕型β-地貧(攜帶者)。見表1。

表1 2例患兒的血液學表型結果

2.2基因檢測結果 2例患兒均未檢出17種中國人群常見的β-地貧基因突變類型。經HBB基因序列分析，發現2例患兒均為HBB基因IVS Ⅱ-705(T>G)雜合突變，國際命名法(HGVS name)為HBB:c.316-146T>G。該突變為HBB基因第二個內含子的705號堿基T突變為G，為致病性突變，臨床表型為β+。見圖1。IVS Ⅱ-705(T>G)突變形成的異常HBB基因mRNA剪接體見圖2。

注：A、B分別為患兒1、患兒2的HBB基因IVS Ⅱ-705(T>G)雜合突變(箭頭所示為突變基因位點)。圖1 2例患兒HBB基因測序結果

注：標識508的箭頭為IVS Ⅱ-508位點，潛在的3′剪接受體；標識705的箭頭為IVS Ⅱ-705(T>G)突變位點，產生5′剪接位點。圖2 IVS Ⅱ-705(T>G)突變引起異常剪接示意圖

3 討 論

β-地貧是一種遺傳異質性較大的溶血性貧血病，已發現的HBB基因突變類型有800多種，其中致病性突變有300多種。不同地域和人群的β-地貧基因突變譜存在較大差異。盡管我國南方地區常見β-地貧基因突變類型基本一致，但不同地區最常見的突變類型有所不同，如廣東、廣西以CD41-42(-TCTT)最為常見，福建、江西以IVS-Ⅱ-654(C>T)最為常見，貴州、重慶以CD17(A>T)最為常見，云南以CD26(G>A)最為常見[7]。目前國內臨床實驗室常用β-地貧基因檢測方法可檢出中國人群常見的17種突變類型，但不能檢測到罕見的突變類型，在臨床應用上具有一定的局限性。

本研究中的2例患兒均表現為輕度小細胞低色素性貧血，且Hb電泳HbA2升高，為典型的輕型β-地貧表型。采用常用的β-地貧基因檢測方法未檢測出中國人群常見的17種突變類型，考慮可能存在罕見β-地貧基因類型。采用Sanger測序發現2例患兒均為HBB基因IVS Ⅱ-705(T>G)雜合攜帶者。在HbVar數據庫的收錄信息顯示為致病性突變，臨床表型為β+。2例患兒的基因型與表型一致，診斷輕型β-地貧明確。

IVS Ⅱ-705(T>G)是一種非常罕見的β-地貧基因突變類型，最早是由美國學者MAQUAT等[8]于1980年報道。隨后，DOBKIN等[9]研究發現，IVS Ⅱ-705(T>G)突變導致了在HBB基因IVS Ⅱ內產生了一個新的功能性的5′剪接位點GAG GTA AGA，與IVS Ⅱ正常的3′剪接受體之間產前一個潛在的剪接體。同時，IVS Ⅱ-705(T>G)突變還激活了IVSⅡ第508位潛在的3′剪接受體，與IVS Ⅱ正常的5′剪接供體之間產前異常剪接。因此，IVS Ⅱ-705(T>G)突變阻止了IVS Ⅱ正常的5′剪接位點與3′剪接受體之間的剪接，從而形成異常的HBB基因mRNA剪接體(圖2)。

國內外對IVS Ⅱ-705(T>G)突變位點的報道很少。國內僅JIANG等[10]在廣東的一個家系中發現2例IVS Ⅱ-705(T>G)雜合攜帶者，紅細胞參數均表現為MCV、MCH降低，HbA2升高，其中1例有輕度貧血。MURAD等[11]在一個敘利亞家系中發現2例IVS-Ⅰ-1(G>A)/IVS-Ⅱ-705(T>G)復合雜合患者，臨床表現為重型β-地貧，Hb分別為46 g/L和52 g/L。本研究發現的2例IVS Ⅱ-705(T>G)雜合攜帶者均表現為輕度小細胞低色素貧血。因此，IVS Ⅱ-705(T>G)突變攜帶者臨床上表現為輕型β-地貧，多數有輕度貧血。當IVS Ⅱ-705(T>G)突變合并有其他β-地貧基因突變位點時，可表現為重型或中間型β-地貧。其他人群中尚未見該突變位點報道。本研究在貴州地區發現較罕見的IVS Ⅱ-705(T>G)突變。

IVS Ⅱ-705(T>G)突變位點不在常規實驗室β-地貧基因突變檢測的位點范圍內，容易造成漏診。為提高β-地貧基因突變檢測的靈敏度，需要結合患者的血液學表型和基因型進行綜合分析。經血液學表型檢查提示為β-地貧，但常規方法檢測為陰性的樣本，需要進一步采用Sange測序和MLPA技術等二線技術檢測罕見的HBB基因點突變和大片段缺失突變。此外，有條件的實驗室也可采用二代測序(NGS)技術直接檢測β-地貧基因突變。有研究報道NGS可將地中海貧血高風險夫婦基因突變的檢出率提高到23.2%[12-13]。盡管NGS檢測β-地貧基因的靈敏度很高，尤其是提高了罕見突變類型的檢測率，但仍存在一些不能檢出的位點。由于檢測過程中還存在其他影響因素，任何一種檢測方法均存在假陰性的可能。因此，臨床上仍然要重視β-地貧表型分析，當表型與基因型不一致時，需要重新檢測或采用多種方法聯合檢測以避免假陰性的發生。