長鏈非編碼RNA對肺癌發生、發展、診斷及預后評估作用的研究進展*

陳 宇 綜述,張艷亮審校

昆明醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗科/云南省檢驗醫學重點實驗室/云南省醫學檢驗臨床研究中心/云南省臨床檢驗診斷省創新團隊，云南昆明 650000

肺癌是指起源于肺部支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，可分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)，其中NSCLC約為85%，是最常見的病理類型。長期以來，肺癌都是世界范圍內發病率極高的惡性腫瘤，且是癌癥患者死亡的最主要原因。2021年統計數據顯示，肺癌患者約占癌癥相關死亡人數的22%，5年生存率僅21%[1]。發病機制的闡明對肺癌的早期診斷及有效治療意義重大。近年來，lncRNA在腫瘤發生、發展中的作用引起了研究人員的廣泛關注。lncRNA是一類轉錄本超過200個核苷酸、不具有或僅具有有限編碼功能的內源性單鏈RNAs[2]。早期研究認為lncRNA是基因轉錄的“噪音”“垃圾”。現有研究表明異常表達的lncRNA可通過表觀遺傳調控、選擇性剪接、微小RNA(miRNA)樣分子等多種機制在包括肺癌在內的多種腫瘤的發生、發展中發揮重要作用[3]。因此，了解lncRNA影響肺癌發生、發展的研究進展對評價lncRNA在肺癌診療中的潛在應用價值具有重要意義。

1 lncRNA作用機制概述

隨著轉錄組測序的發展，越來越多的非編碼RNA被發現，其中lncRNA約占68%[4]。近年來，研究發現少數lncRNA具有小開放閱讀框，可以翻譯成具有生物活性的多肽[5]，如LINC00460在一定條件下可以編碼小肽，但其中的分子機制尚不清楚[6]。而絕大多數lncRNA雖然不能編碼蛋白質，但能通過轉錄前水平、轉錄水平和轉錄后水平調控基因表達，進而參與細胞生物學過程[7]。

1.1轉錄前水平調控 許多lncRNA可以招募染色質修飾復合物到特定DNA上，調節染色質上的核小體定位或組蛋白修飾，實現從轉錄前水平調控基因轉錄。例如，長鏈非編碼RNA 肺腺癌轉移相關轉錄本1(lncRNA MALAT1)過表達能將染色質修飾復合體招募到結節硬化復合物2蛋白(TSC2)基因的啟動子區域，從而抑制TSC2基因轉錄[8]。一些lncRNA能通過表觀遺傳途徑影響基因前轉錄，甲基化是常見的表觀遺傳修飾方式。lncRNA MIR210HG能與DNA甲基轉移酶(DNMT1)結合，促進電壓依賴性鈣通道的輔助亞基(CACNA2D2)啟動子區域的甲基化，抑制CACNA2D2基因表達[9]。lncRNA二肽基肽酶10的反義RNA1(DPP10-AS1)和蛋白編碼基因DPP10在肺癌中協同上調且二者存在4個共同的甲基化位點，DPP10-AS1可調節DPP10的甲基化狀態[10]。

1.2轉錄水平調控 基因轉錄的過程需要多種因子如轉錄因子、聚合酶、增強子等的參與，lncRNA能與這些因子結合并調控其活性，從而影響基因轉錄水平。lncRNA叉頭框蛋白C2的反義RNA1(FOXC2-AS1)能與轉錄因子FOXC2形成RNA-RNA雙鏈結構，增加FOXC2的表達，進一步促進ATP結合盒亞家族B成員1(ABCB1)基因表達[11]。也有研究表明在熱休克過程中，lncRNA可與RNA聚合酶Ⅱ直接接觸，抑制特定mRNA的轉錄[12]。

1.3轉錄后水平調控 lncRNA能以堿基配對的方式與其他RNA或DNA特異性結合，且這種配對能發生在基因表達的任何時間點，因此lncRNA能影響mRNA的轉錄、加工、編輯、翻譯或降解。lncRNA WT1-AS在NSCLC中表達下調，lncRNA尿路上皮癌原基因1(UCA1)在NSCLC中表達上調，二者呈負相關。而WT1-AS的過表達使UCA1的表達受到抑制；UCA1可促進NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲，而WT1-AS則通過下調UCA1并促進p53表達抑制這些過程[13]。另外，lncRNA可以通過與miRNA的5′端序列結合，作為miRNA的競爭性內源RNA(ceRNA)，影響miRNA對下游mRNA的調節作用。lncRNA生長抑制特異性基因(5GAS5)通過影響miR-23a的表達，從而調控自噬相關基因3(ATG3)表達[14]。類似地，miR-365也能靶向ATG3 mRNA的3′非編碼區，抑制其表達，而lncRNA漿細胞瘤多樣異位基因1(PVT1)可作為miR-365的ceRNA降低其對mRNA的作用，從而上調ATG3基因表達[15]。

2 lncRNA在肺癌發生、侵襲轉移和耐藥的作用

近年來不斷有研究通過高通量測序技術以及生物信息學分析等陸續發現了眾多在肺癌中表達失調的lncRNA，這些lncRNA與肺癌的發生密切相關，且通過功能研究發現它們能夠影響肺癌的侵襲轉移和耐藥等生物學特性。

2.1lncRNA與肺癌的發生 肺癌的發生是一個多基因參與的復雜生物學過程，目前已發現許多lncRNA在肺癌組織中差異表達，它們可能在肺癌發生、發展中扮演重要角色。張艷秋[16]利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫和表達譜芯片分別篩選與肺癌相關的差異表達lncRNA，并綜合分析篩選出11個異常表達的lncRNA。WANG等[17]對從高通量基因表達(GEO)數據庫篩選得到新的肺癌相關lncRNA AC079630.4，并對其進行生物信息學分析預測其潛在功能，發現AC079630.4主要與細胞凋亡以及腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)信號通路相關，且經細胞功能實驗驗證，AC079630.4過表達可顯著抑制肺癌細胞的增殖和克隆，上調TRAIL受體的表達，因此AC079630.4在肺癌發生中起著抑制因子的作用。WANG 等[18]采用生物信息學方法篩選并在59對肺腺癌及癌旁組織中驗證，發現了3種表達上調且與患者總體生存率呈負相關的lncRNA(CASC8、LINC01842、VPS9D1-AS1)。其中VPS9D1-AS1通過發揮ceRNA的功能，靶向miR-532-3p并正向調節高遷移率族蛋白A2(HMGA2)蛋白的表達，促進NSCLC的發生發展[19]。

高通量測序技術的應用為尋找與肺癌相關的lncRNA提供了便捷，但篩選出的許多lncRNA具體功能和機制還不清楚。肺癌的發生可能涉及多種lncRNA，這些lncRNA是否存在以及如何發揮作用也尚未可知，仍需進一步研究。

2.2lncRNA與肺癌的侵襲轉移 侵襲和轉移是惡性腫瘤的一大特征，也是腫瘤復發的最主要原因之一，且肺癌患者即使手術切除原發病灶后仍可能復發，這涉及多種生物學過程如上皮間質轉化(EMT)、血管生成等，而lncRNA可調節這些過程從而參與肺癌細胞的侵襲轉移。

轉化生長因子(TGF)是EMT過程的重要作用因子。肝細胞癌預后不良相關lncRNA(lncRNA AWPPH)在發生轉移的NSCLC患者中顯著上調，并能促進細胞TGF-β1表達，而抑制TGF-β1能減低AWPPH對NSCLC侵襲轉移的促進作用，提示AWPPH過表達可能通過激活TGF-β1信號通路參與EMT過程，促進NSCLC的侵襲轉移[20]。lncRNA X-非活性特異轉錄物(XIST)在肺癌中過表達，可作為ceRNA下調miR-367/141的表達，從而增加E盒結合鋅指蛋白(ZEB蛋白)的表達，促進EMT過程[21]。LIU等[22]同樣對XIST進行了研究，他們的結果顯示XIST通過影響細胞增殖發揮作用，敲低XIST后，細胞周期相關蛋白表達量減少，細胞增殖受到抑制，細胞存活率降低。類似地，lncRNA生長停滯特異性轉錄物5(GAS5)也能同時影響細胞凋亡和侵襲轉移。GAS5在肺癌中低表達，過表達GAS5可吸附miRNA-29-3p從而促進抑癌基因磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)的表達，抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)蛋白磷酸化，進而抑制靜脈內皮細胞的增殖，并促進其凋亡[23]。GAS5還能誘導EMT過程中上皮標志蛋白E-鈣黏蛋白表達并抑制間質標志蛋白N-鈣黏蛋白表達，抑制細胞侵襲轉移[24]。

目前研究顯示，lncRNA在肺癌細胞侵襲轉移中的確發揮重要作用，但其中的具體機制尚未完全闡明，不同研究人員對同一lncRNA進行研究時，可能會發現其發揮生物學功能的途徑有所不同。這可能是由于同一種lncRNA在肺癌中發揮作用時可能存在多種途徑，最終都導致同樣的促癌或抑癌作用。

2.3lncRNA與肺癌耐藥 肺癌患者早期雖可手術切除治療，但事實上許多患者確診時已進展到了中晚期，沒有手術指征或已發生轉移，仍需靶向治療或化療。抗癌藥的使用前期雖取得了一定的臨床療效，但患者卻也逐漸產生了耐藥性，這一過程lncRNA也參與其中。

順鉑是目前應用于晚期肺癌的標準抗癌藥，順鉑的抗腫瘤作用主要是通過與DNA結合形成復合物，阻礙其復制和轉錄，并激活各種信號通路，最終導致細胞凋亡[25]。lncRNA能影響這些通路從而參與耐藥。如AKT/mTOR信號通路的激活可抑制細胞凋亡、促進細胞增殖[26]。lncRNA核富集轉錄本1(NEAT1)可激活AKT/mTOR信號通路，促進肺癌細胞耐藥[27]。miR-101-3p的表達促進肺癌細胞對順鉑敏感，且能有效抑制糖酵解，而lncRNA XIST可作為miR-101-3p的ceRNA，顯著促進肺癌細胞的糖酵解，從而介導肺癌細胞對順鉑產生耐藥[28]。有研究表明自噬也可改變NSCLC細胞對化療的敏感性[29]。lncRNA膀胱癌相關轉錄物1(BLACAT)就通過調節自噬參與順鉑耐藥，它作為ceRNA下調miR-17的表達，上調自噬相關蛋白的表達，促進自噬，參與順鉑耐藥[30]。另外，除了順鉑，lncRNA也可誘導其他藥物的耐藥，如lncRNA代謝誘導的腫瘤激活因子1(MITA1)通過誘導肺癌細胞自噬促進吉非替尼耐藥[31]。

總之，lncRNA可通過調節細胞凋亡、細胞自噬等參與NSCLC患者耐藥的發生，對這些作用機制研究有助于尋找防止耐藥發生的新方法。

3 lncRNA在肺癌診斷及預后評估中的價值

3.1lncRNA作為生物標志物診斷肺癌 目前臨床診斷肺癌主要依靠支氣管鏡檢、病理活檢、腫瘤標志物檢測和影像學檢查。但肺癌患者早期缺乏典型的臨床表現，影像學表現難以與炎癥、結核等區別，且放射性物質對機體有害。支氣管鏡檢和病理活檢雖可作為金標準，但其具有侵襲性，患者依從性不高。而目前的腫瘤標志物由于靈敏度、特異度不高，診斷效能有限。因此探尋有效的早期診斷標志物仍是肺癌研究中的一大問題。

某些lncRNA能穩定地存在于人的血清或血漿中[32]，這為lncRNA作為肺癌的診斷標志物提供了可能。XIE等[33]構建了由lncRNA SOX2重疊轉錄本(SOX2OT)、INK4基因座的一種反義非編碼RNA(ANRIL)與常規肺癌標志物癌胚抗原(CEA)、細胞角質蛋白19片段抗原21-1(CYFRA21-1)、鱗狀細胞癌抗原(SCCA)聯合診斷NSCLC的診斷模型，其診斷效能明顯優于單獨使用一種標志物；不僅如此，該研究還驗證了血清經過室溫孵育不同時間以及反復凍融不同次數后SOX2OT和ANRIL的穩定性，結果顯示SOX2OT和ANRIL的相對表達水平沒有明顯變化。TBILA和AGAP2-AS1可能作為NSCLC的潛在診斷標志物，雖然與單獨檢測相比，二者聯合檢測不能提升診斷效能，但與CYFRA21-1聯合檢測能提高準確性[34]，可這項研究并未驗證TBILA和AGAP2-AS1在血清中的穩定性。除了尋求血清中游離lncRNA，研究人員也在努力探索血細胞中的lncRNA作為標志物的可能性。在腫瘤發展過程中，血小板受到癌細胞的影響可改變其分子表達，肺癌和早期肺癌患者血小板中的lncRNA linc-GTF2H2-1和RP3-466P17.2都顯著下調，而ST8SIA4-12顯著上調，將三者聯合檢測比單獨檢測對肺癌和早期肺癌的診斷效能均有提高；此外，聯合檢測linc-GTF2H2-1和CEA、CYFRA21-1、神經元特異性烯醇化酶(NSE)能有效鑒別早期和晚期肺癌[35]。

由此可見，就診斷效能來說，lncRNA有望成為新的肺癌診斷標志物，且與常規腫瘤標志物或多種lncRNA聯合檢測優于單獨檢測。但lncRNA畢竟是RNA的一種，由于RNA酶的廣泛存在，不能保證血清中所有游離lncRNA均穩定存在，因此在將其作為診斷標志物前還需要驗證其穩定性。另外，血細胞如血小板中也存在可能作為診斷標志物的lncRNA，這為發掘新的肺癌標志物提供了新思路。

3.2lncRNA與肺癌預后相關 肺癌患者預后差主要是由于早期不易確診、易復發轉移、化療耐藥等，因此與侵襲轉移、耐藥機制相關的lncRNA都可能與預后密切相關。預后差的肺癌患者通常TNM分期較晚，且已發生淋巴結轉移，許多lncRNA與這些臨床病理特征相關，可能是肺癌預后差的獨立危險因素。

例如，lncRNA PVT1在肺癌中表達上調，與PVT1低表達相比，高表達的肺癌患者預后更差[36]。lncRNA DLX-AS高表達與肺癌細胞分化程度及TNM分期顯著相關[37]。lnRNA結合蛋白轉錄因子亞基β1-內含子轉錄本1(GABPB1-IT1)在NSCLC患者中低表達，且TNM分期高者較分期低者表達水平更低，而高表達者的總體生存率高于低表達者，提示GABPB1-IT1可能作為NSCLC患者的預后標志物[38]。

這些研究說明，lncRNA與肺癌患者預后具有一定相關性，尋找與肺癌TNM分期、淋巴結轉移等病理特征相關的lncRNA并應用于臨床監控將有助于及時評估患者預后。

4 小結與展望

近年來，基因芯片和高通量測序技術的發展逐步成熟，在肺癌中表達失調的lncRNA越來越多地被發現。但對于這些lncRNA的功能機制研究就相對滯后，絕大多數與肺癌相關的lncRNA的生物學效應尚未了解完全，以及是否能用于臨床診斷和預后判斷也需要經過大量驗證。但毋庸置疑的是，lncRNA與肺癌關系密切，是肺癌潛在的生物標志物，相信隨著研究的深入，lncRNA能為肺癌的診療及預后判斷提供新途徑。