模式生物斑馬魚在卒中研究中的應用

莫東燦，劉柳余，李肖玲，李建立，羅曼

卒中在我國城市和農村，是致殘和死亡的首要原因，據統計，全國每年新發卒中約200萬人，死于卒中約110萬人，且發病率逐年增加，給患者家庭和社會造成沉重的負擔[1]。卒中病因及發病機制如今尚未完全闡明，防治措施相對有限，動物模型為探索其病理生理演變及藥物研發提供了必要工具。雖然嚙齒類動物在卒中研究中使用廣泛，但其在遺傳學、發育生物學和藥物篩查研究中具有一定的局限性。斑馬魚（zebrafish，Danio rerio）是一種理想的脊椎模式生物，在活體血管研究方面更是具備自身的特點及優勢，已被越來越多地應用于腦血管病的研究當中，本文將對此作一綜述。

1 斑馬魚腦血管系統發育及生物學特點

1．1 斑馬魚的腦血管系統發育過程 斑馬魚在受精后20 h左右，兩條靜脈——原始后腦通道逐漸形成，并沿著后腦腹側的前后軸平行分布[2]。在受精后28～32 h，新生血管從兩條原始后腦通道的內側芽生，并向中線遷移，垂直于前后軸形成基底動脈[3]。受精后約32 h，中央動脈開始從原始后腦通道的背側芽生，并逐漸向背側遷移，然后轉向腹側與基底動脈或后交通動脈相連，形成拱形結構。在受精后約36 h，中腦中央動脈從脈絡膜血管叢芽生，并延伸多個分支與基底交通動脈相連，或在它們之間形成復雜的血管環[4]。這一時期，頸內動脈的尾部分支形成并向尾部延伸，與基底交通動脈及后交通動脈相連，形成一個結構上與人類大腦動脈環（circle of Willis）相似的血管環[1]。

1．2 斑馬魚與人類基因組的相似性與差異性 斑馬魚與人類基因組具有相似性與差異性。二者蛋白質編碼基因的直接比較揭示了許多有趣的特征。71．4%的人類基因至少有1個斑馬魚同源基因，反過來，69%的斑馬魚基因至少有1個人類同源基因。在同源基因中，47%的人類基因與斑馬魚同源基因存在一對一的關系[5]。說明斑馬魚作為模式生物，對于人類疾病研究非常重要。現有研究表明，斑馬魚基因組的隨機突變中，已經鑒定出5494個同源基因中的3188個基因突變與人類疾病相關[6]。另外，斑馬魚與人類的基因組必然存在差異，與人類基因組相比，斑馬魚基因組中的假基因很少。研究人員在斑馬魚基因組中鑒定了154個假基因，而人類基因組中的假基因約有13 000個，假基因被認為是在進化中喪失了功能的基因[6]。

1．3 斑馬魚在腦血管疾病方面的研究優勢 腦血管疾病研究領域中，斑馬魚相對傳統的模式生物而言，有其獨特的優勢，體現在多個方面：

（1）斑馬魚體型雖小，但產卵量大、生長周期短，養殖并不繁瑣且費用低廉，是一種可提高實驗效率的脊椎模式生物。與許多哺乳動物的受精方式不同，斑馬魚胚胎及幼魚身體透明，利用轉基因斑馬魚，例如在內皮中表達綠色熒光蛋白的tg（flk1：gfp）斑馬魚可以便捷地用熒光顯微鏡觀察到全身血管[7]。

（2）在腦血管生成和血腦屏障結構方面，斑馬魚與哺乳動物具有極高的相似性。不僅在腦血管的發育和功能上與哺乳動物具有高度一致性，而且在促進血管生成的細胞和分子機制上具有高度的保守性[3，8]。同時，斑馬魚的免疫系統與哺乳動物相似，包括具備相對完整的適應性免疫系統和保守的先天性免疫系統。

（3）斑馬魚胚胎及幼魚能夠進行活體成像，允許實時可視化血管生成的觀察，并可以在空間和時間上判斷斑馬魚血流動力學和血管結構的變化[9-10]，使得斑馬魚在腦血管疾病研究中的地位愈發重要。

（4）斑馬魚的全基因組測序工作已完成，其遺傳序列與人類遺傳序列高度保守。同時針對斑馬魚的基因操作技術已非常成熟，通過靶向修飾或敲除某些基因改變其表達水平，可以較容易地對興趣基因進行精確操作，非常適合進行人類疾病建模及機制研究。

2 斑馬魚在卒中研究中的應用現狀

2．1 缺血性卒中 卒中分為缺血性卒中和出血性卒中兩類，我國缺血性卒中約占全部卒中的69．6%～70．8%[11]。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是缺血性卒中的最常見病因學亞型——大動脈粥樣硬化型卒中的主要病理基礎，血漿膽固醇水平升高是AS的主要驅動因素。嚙齒類動物對AS形成具有天然的抵抗力，使得利用該物種進行AS研究具有內在的難度。許多其他的非嚙齒動物實驗模型也無法模擬人類脂蛋白的組成和AS的發生[12]。目前，斑馬魚被認為是研究AS機制和治療靶點的極好的模式生物，在AS研究中顯示出了無法比擬的優勢：首先，斑馬魚的脂蛋白生物學和代謝特點與人類基本相同[13]；其次，斑馬魚通過喂飼高膽固醇飲食很容易誘發與人類相似的以低密度脂蛋白水平增高為主的高膽固醇血癥，而不同于嚙齒動物高密度脂蛋白水平升高為主的模式[13]；再次，短時間暴露于高膽固醇飲食后，斑馬魚幼魚即可出現低密度脂蛋白的氧化、巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白的吞噬、脂質在血管壁的沉積以及向內膜下浸潤及血管壁脂質條紋的形成，這和人類AS早期的病理變化相同[13-14]；最后，由于斑馬魚幼魚魚體透明，可在共聚焦顯微鏡下實時成像追蹤氧化低密度脂蛋白顆粒，動態觀察活體動脈內AS的整個發生發展過程[14-15]，具有其他動物模型無法比擬的優越性。

由于基因編輯方面的優勢，斑馬魚為缺血性卒中相關基因功能的研究提供了廣闊平臺，例如斑馬魚是研究claudin-5、Zo-1、Wnt等血腦屏障滲漏相關蛋白功能的有效模式生物[16-18]，因此逐漸被用于腦小血管病血管完整性的研究當中[5]。此外，還有研究利用斑馬魚對NOTCH3、FOXF2、VEGFA、GSPT1L等基因在缺血性卒中病理生理過程中的作用進行研究[19-22]。

2．2 出血性卒中 出血性卒中發病率雖然只占全部卒中的20%～30%，但病死率極高，預后較缺血性卒中更差[23]。出血性卒中包含腦出血和蛛網膜下腔出血。腦出血的常見病因主要是以高血壓合并小動脈硬化、微血管瘤，另外腦淀粉樣血管病、動靜脈畸形、腦海綿狀血管瘤、顱內動脈瘤等也會導致腦出血的發生。蛛網膜下腔出血的最常見病因則是顱內動脈瘤破裂。

由于只需要傳統的倒置光學顯微鏡就可以方便而直接地觀察顱內出血，因此斑馬魚已被廣泛地應用于出血性卒中的研究中[24]。例如，Donnini等[25]發現β淀粉樣蛋白可誘導斑馬魚內皮細胞老化、微血管形態和功能漸進性改變，提出這可能是散發性或遺傳性腦淀粉樣血管病的潛在發病機制之一。Sung等[26]發現斑馬魚的alk1基因敲除會造成顱內大動脈異常擴張并與靜脈直接相連，這與alk1基因突變患者的腦內動靜脈畸形血管表型相似。目前已經確定了腦海綿狀血管瘤三個致病基因（CCM1、CCM2和CCM3）的斑馬魚同源基因[27-28]，研究者通過基因編輯技術或嗎啉寡聚核苷酸技術對斑馬魚同源基因進行敲除，觀察到斑馬魚形成易于出血的薄壁擴張血管，這與人類腦海綿狀血管瘤病理改變相似[28]，可作為人類腦海綿狀血管瘤的動物模型并用以探討該病的發病機制。斑馬魚還被用于顱內動脈瘤形成有關的基因研究，Santiago-Sim等[29]通過全外顯子測序發現的thsd1基因可能與顱內動脈瘤發生發展有關，進而在thsd1基因敲除斑馬魚上觀察到顱內出血。

在機制研究方面，內皮連接穩定性和血管系統完整性的破壞被認為是出血性卒中的重要發病機制之一，而斑馬魚在研究血管完整性方面具備一定的優越性，因此，有越來越多的學者應用斑馬魚進行這方面的研究。例如Zou等[30]利用斑馬魚進行微小核糖核酸（microRNA，miR）研究，結果發現miR-126在斑馬魚血管表達豐富，起到維持血管完整性的作用，敲除miR-126基因會導致斑馬魚顱內出血。

2．3 利用斑馬魚進行卒中藥物研究 成年斑馬魚在每次交配中可以產生多達300個胚胎，研究者一次可以對數千個有機體進行實驗。由于斑馬魚胚胎的直徑遠小于1 mm，因此可以在96或384孔板上進行實驗。大多數小分子很容易滲透到斑馬魚體內，只需將藥物稀釋到魚水中即可有效地“治療”生物體。而斑馬魚最大的特點在于胚胎透明，可從活體觀察到所有血管結構，從而可以在顯微鏡下多角度地觀察到血管的發生發展和動力學過程，是一種理想的血管研究活體動物模型[31]。斑馬魚的微觀尺寸、高繁殖力和易給藥性，加上易于識別血管表型，使其已成為常用的活體高通量腦血管藥物篩選工具，并逐漸拓展至新藥開發及藥理學領域。

Zhu等[32]建立了斑馬魚血栓形成的藥物篩選及療效評價模型，并驗證阿司匹林、氯吡格雷等藥物對斑馬魚血栓形成均有顯著的預防和治療作用。Yi等[33]通過斑馬魚模型對中藥茜草的藥理作用進行研究，發現茜草提取物在斑馬魚體內具有抗血栓形成和促血管生成活性，主要活性成分可能為蒽醌類和萘醌類。Peterson等[34]發現利用斑馬魚篩選出的兩種小分子物質GS4012和GS3999可以通過誘導血管內皮生長因子的表達而使斑馬魚閉塞的動脈恢復通暢。隨著斑馬魚高分辨在體成像技術、自動化分選技術及定量化數據分析技術的發展，未來斑馬魚在腦血管藥物研究方面將具有更為廣闊的應用前景，并將為開發出安全、有效的藥物做出巨大貢獻。

2．4 斑馬魚在卒中研究中的不足之處 當前研究中，斑馬魚具備自身特點及優勢的同時也存在著一定的局限性。第一，藥物篩選研究中，傳統嚙齒類動物的給藥方式多樣，飼喂、灌胃、靜脈注射、腹腔注射等，可根據藥物特性選擇恰當的給藥方式，而斑馬魚大多采用浸泡給藥，適合水溶性較好的藥物進行干預及評價，而在水溶性不佳的藥物研究中，斑馬魚并非首選[35]。第二，斑馬魚研究起步較晚，圍繞其開展的實驗技術較少，傳統模式生物在分子機制研究中多利用抗原抗體反應進行多方式的驗證，如免疫印跡實驗、免疫熒光實驗、免疫共沉淀實驗等，但目前針對斑馬魚為靶向種屬設計的抗體仍是極度缺乏的，所以斑馬魚的信號通路體系建設仍需完善[36]。第三，國際上對斑馬魚研究的標準化明顯滯后[37]，如實驗設計倫理的標準化、實驗相關技術開展的標準化、實驗結果觀察指標的標準化等，還需很長一段路要走。

斑馬魚在卒中研究中具有其他模式生物所不具備的獨特優勢，其不僅在基因功能研究中操作十分便利，還可以作為高通量藥物篩選的實施平臺，目前已越來越多地被應用于出血性及缺血性腦血管病研究中。雖然斑馬魚在卒中研究中仍存在著一些不足之處，但相信隨著技術的日益完善，這一模式生物有望為人類探索腦血管疾病的發病機制提供新的工具，并幫助研究者發現新的藥物靶點及治療方法。

【點睛】本文通過總結歸納斑馬魚相對于傳統模式生物在體型、繁殖能力、成本上的優勢，以及血管可視性佳、遺傳序列與人類高度相近、藥物篩選便捷等特點，為卒中領域研究者在模型構建與模式生物的選用上提供了參考。