過表達PRDM14非小細胞肺癌腫瘤細胞株的構(gòu)建

盧亞楠，劉思瓏，麻雨晴，劉夢琪，齊 悅

(北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100094)

引言

伴隨著全球老齡化加劇，世界范圍內(nèi)患癌患者的人數(shù)不斷上升，中國作為人口大國，無論是患癌患者還是因癌癥死亡的人數(shù)都不容小覷。在世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)發(fā)布的2020年全球最新癌癥負擔(dān)數(shù)據(jù)中顯示，2020年全球癌癥死亡病例996萬例，其中中國新發(fā)癌癥457萬人，將近占全球的24%，而肺癌死亡人數(shù)就高達180萬例，遠超其他癌癥類型，位居因癌癥死亡人數(shù)第一。

根據(jù)病理組織不同，肺癌具體分為非小細胞癌和小細胞癌兩種。非小細胞肺癌約占所有肺癌的85%，主要分為腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌三個亞型。與小細胞癌相比，非小細胞肺癌癌細胞生長分裂較慢，擴散轉(zhuǎn)移相對較晚，因此約75%的患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，5年生存率不足30%，手術(shù)治療效果不理想，只能進行以化療為主的綜合性治療。

PRDM14(正性調(diào)節(jié)區(qū)鋅指蛋白14)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是PRDM家族成員之一，與細胞的增殖調(diào)控、分化、發(fā)育等密切相關(guān)，癌癥以及一些其他疾病也與該因子異常有關(guān)。PRDM14在N端有1個PR結(jié)構(gòu)域，在C端有6個鋅指結(jié)構(gòu)，含有的SET蛋白結(jié)構(gòu)域已經(jīng)檢測到組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可以對靶基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進行直接修飾，以此來實現(xiàn)基因的表達調(diào)控 。

劉冰冰等研究發(fā)現(xiàn)隨著肺癌細胞分化程度的升高，PRDM14的表達水平也升高，推測PRDM14在肺癌發(fā)生的早期起作用，促進細胞增殖，在肺癌發(fā)展到嚴重分化不良時，可能由于PR域的CpG島甲基化使mRNA表達受到抑制，引起了其蛋白表達的下調(diào)。另利用Western blot技術(shù)檢測了PRDM14蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達情況，結(jié)果顯示PRDM14蛋白的表達在肺鱗癌和腺癌中均高于癌旁正常組織，而且與非小細胞癌的分化程度有關(guān)，這提示我們PRDM14在非小細胞肺癌早期起著重要的作用。

Zhang等分析了手術(shù)切除后非小細胞肺癌病人PRDM14的表達水平與其預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示PRDM14在35.65 %的原發(fā)腫瘤樣本中表達增加，在39.68 %的伴有淋巴轉(zhuǎn)移的樣本中表達增加，PRDM14表達的增加與腫瘤細胞的分化程度顯著相關(guān)(p= 0.008)。因此，PRDM14可能成為非小細胞肺癌不良預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。

近年來精準(zhǔn)醫(yī)療的快速發(fā)展，基因靶向治療是近年來新興的治療手段，具有特異性識別腫瘤細胞并殺死腫瘤細胞，對其他細胞危害較少等優(yōu)點。靶向治療為非小細胞癌提供了新的治療手段，PRDM14基因有望成為非小細胞肺癌早期診斷和預(yù)后評估的新靶點。

本研究通過克隆人PRDM14基因，構(gòu)建真核過表達載體后轉(zhuǎn)染人的非小細胞肺癌細胞，得到高表達PRDM14的非小細胞肺癌細胞株，該細胞株不僅可以為后續(xù)非小細胞肺癌發(fā)生、發(fā)展以及耐藥性等相關(guān)研究提供實驗材料，還可以為后續(xù)靶向治療非小細胞肺癌的方法探尋奠定理論基礎(chǔ)。

一、實驗材料

(一)實驗耗材

NCI-H1975肺腺癌細胞系為中藥與生物技術(shù)實驗教學(xué)中心細胞房凍存；無水乙醇、異丙醇、1×TBE緩沖液、6×Loading Buffer、氨芐抗生素、LB培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、二甲基亞砜、1×TBST、脫脂奶粉、pcDNA3.1質(zhì)粒和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞等均購自北京愛科嘉生物科技有限公司。其余實驗耗材見表1所列。

表1 實驗耗材及品牌

(二)主要儀器

實驗使用的主要儀器見表2。

表2 主要儀器及型號

二、實驗方法

(一)PRDM14引物設(shè)計和基因擴增

在NCBI上獲取人的PRDM14 cDNA序列(基因序列號：NM_024504.4)，采用Primer Premier 5.0設(shè)計上游引物F：5’-TAGTCCAGTGTGGTGGAATTCATGGCTCTACCCCG-3’和下游引物R：5’-ACGGGCCCTCTAGEACTAGTAGTCTTCATGAAACTTCATGTGG-3’，引物中含有載體同源臂序列。以人的胚胎干細胞cDNA為模板，通過PCR擴增得到PRDM14。

PCR擴增條件：95℃預(yù)變性10 min，94℃變性15 s，56℃退火5 s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次，72℃終延伸5 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物條帶，參照Magen凝膠DNA小量回收試劑盒的方法進行回收純化。

(二)重組載體的構(gòu)建

用EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切pcDNA3.1載體質(zhì)粒，用膠回收試劑盒回收質(zhì)粒并實行純化。利用諾維贊同源重組試劑盒，建立目的片段PRDM14與pcDNA3.1載體的無縫克隆連接體系，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，置于氨芐抗性平板上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，次日挑選單克隆菌落，搖菌后進行菌液PCR檢測，選擇經(jīng)電泳驗證條帶正確的菌液送生物公司測序。參照Magen去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒進行質(zhì)粒提取。

(三)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的NCI-H1975細胞接種于6孔板中，待細胞密度達70%-80%時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前換液。取一個潔凈無菌離心管，向待轉(zhuǎn)染的六孔板中每孔的NCI-H1975細胞加入125 μL不含抗生素和血清的DMEM培養(yǎng)液，加入2.5 μL質(zhì)粒DNA，并用槍輕輕吹打混勻；再加入4 μL Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑，用槍輕輕吹打混勻后加入6孔板中，培養(yǎng)48 h。設(shè)立空白對照組、pcDNA3.1空載體對照組及pcDNA3.1-prdm14過表達組。

(四)Western blot

用蛋白裂解液提取細胞蛋白質(zhì)，100℃水浴10 min，使其變性后進行SDS-PAGE檢測，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用一抗稀釋液以1∶4000比例稀釋GAPDH Mouse Monoclonal Antibody和Anti-PRDM14，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次5 min；再加以1∶4000比例稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗，室溫輕搖1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；采用化學(xué)發(fā)光法顯色，將發(fā)光液A和B按等體積混合，均勻滴加在PVDF膜上，孵育1 min，在顯影儀中進行顯影并拍照。

三、實驗結(jié)果

(一)PCR擴增PRDM14基因電泳結(jié)果

人的PRDM14 CDS全長為1716 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示，條帶大小與預(yù)期大小一致，可以進行膠回收純化，得到目的基因片段。

圖1 PCR擴增得到PRDM14目的基因

(二)pcDNA3.1質(zhì)粒雙酶切電泳結(jié)果

pcDNA3.1質(zhì)粒圖譜如圖2所示，通過建立酶切反應(yīng)體系進行雙酶切，獲得線性化載體片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3所示，雙酶切產(chǎn)物條帶位置與原始質(zhì)粒線性條帶位置一致，說明酶切完全，可以進行膠回收，得到高濃度的線性化載體片段。

圖2 pcDNA3.1質(zhì)粒圖譜

圖3 載體雙酶切電泳鑒定

(三)過表達PRDM14真核表達載體的構(gòu)建

通過酶切連接的方式將PRDM14片段重組到pcDNA3.1載體的多克隆位點，構(gòu)建成pcDNA3.1-prdm14的重組載體。經(jīng)過大腸桿菌擴增和菌液PCR鑒定，PCR鑒定時選擇載體上的T7位點設(shè)計上游引物，在插入目的基因片段上設(shè)計下游引物，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖4所示，在217 bp處有單一條帶的即為陽性克隆，陽性克隆菌測序鑒定正確。提取重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖5所示，條帶位置在7100 bp左右，與預(yù)期一致，測定其濃度為596 ng/μL。

圖4 菌液PCR鑒定陽性克隆

圖5 重組質(zhì)粒電泳結(jié)果

(四)Western Blot檢測PRDM14蛋白的表達

復(fù)蘇培養(yǎng)人非小細胞肺癌細胞系NCI-H1975，待細胞生長至匯合度達70%，以合適密度接種至細胞培養(yǎng)板。利用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒回收重組質(zhì)粒pcDNA3.1-prdm14，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至細胞，72 h后收集細胞并提取蛋白質(zhì)。經(jīng)過Western Blot檢測分析，目的蛋白PRDM14在NCI-H1975細胞中可以正常表達(如圖6所示)。

圖6 Western Blot 檢測PRDM14蛋白的表達

結(jié)語

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率長居前列，同時，還有著早期診斷率低、化療副作用大、五年生存率較低等問題。近年來，探索非小細胞肺癌的靶向治療方式主要有兩個方向：一個是為沒有特異性藥物的已知驅(qū)動基因?qū)ふ业接行У陌邢蛩幬铮硪粋€是尋找新的驅(qū)動基因。越來越多的非小細胞肺癌晚期病人接受了靶向藥物的治療，明顯延長了無進展生存期和總生存期，提高了生活質(zhì)量。目前，已有研究表明PRDM14與非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的聯(lián)系，進一步探究PRDM14對非小細胞肺癌細胞增殖過程的影響，有望為尋找新的治療靶點提供理論依據(jù)。

本研究以人胚胎干細胞cDNA為模板，PCR擴增PRDM14基因片段，將其連接至pcDNA3.1載體并轉(zhuǎn)染至非小細胞肺癌細胞NCI-H1975中，成功構(gòu)建了過表達PRDM14的非小細胞肺癌細胞株，為后續(xù)深入研究該基因的功能提供了重要的實驗材料。