菌群干預(yù)與免疫治療的研究進展

張 慧，胡廣越，殷 紅

（1.馬鞍山市人民醫(yī)院血液科，安徽 馬鞍山 243000；2.蘇州大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，江蘇 蘇州 215006）

隨著全球人口的快速增長和老齡化，癌癥作為人類主要死因的地位日益突出。根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計，癌癥是172 個國家中91 個國家70 歲以前死亡的第1 或第2 大原因，預(yù)計癌癥即將成為21世紀世界各國提高預(yù)期壽命的主要原因和唯一最重要的障礙[1]。目前傳統(tǒng)癌癥治療方式存在治愈率不高的問題，探索新型、有效治療方法成為亟待解決的問題，故免疫治療的興起備受矚目，研究進展最多的為免疫檢查點抑制劑（CTLA-4、PD-1/PD-L1 單抗）。人體腸道內(nèi)有著種類繁多的微生物菌落，起到連接外界環(huán)境和人體環(huán)境的作用。隨著人們對腸道菌群的認識越來越深入，發(fā)現(xiàn)其可以通過直接及間接促癌、影響局部免疫及全身免疫的方式調(diào)節(jié)人類免疫系統(tǒng)，從而在增強抗腫瘤效應(yīng)、改善免疫不良反應(yīng)起到關(guān)鍵作用[2-4]，故通過菌群調(diào)節(jié)方式輔助免疫治療成為學者們的研究熱點，如糞便微生物移植、益生菌等。本文主要總結(jié)近年來國內(nèi)外菌群調(diào)節(jié)方式的研究進展。

1 腸道微生物與腫瘤、免疫治療現(xiàn)狀

1.1 腸道微生物與腫瘤 人體腸道是一個大型微生物群落的生態(tài)系統(tǒng)，具有復(fù)雜性、多樣性、差異性、動態(tài)性，在人類健康與疾病中發(fā)揮的關(guān)鍵作用越來越受到關(guān)注和認知，包括無害的共生菌及致病菌群[5-7]。大量的研究表明，微生物群可通過多種機制促進癌癥的發(fā)生發(fā)展，如釋放基因毒素誘導DNA 損傷、利用LPS 配體（TLRs）和MAMPs 結(jié)合激活釋放促炎因子[8-10]以及有害細菌代謝產(chǎn)物的生成。然而研究也證實菌群發(fā)酵產(chǎn)物短鏈脂肪酸（SCFA）可以誘導髓系免疫細胞和結(jié)腸的Treg 細胞生成發(fā)揮抗炎抑癌作用；部分益生菌，如乳酸桿菌具有抑制癌癥作用。總之，腸道菌群可以直接或者間接的發(fā)揮局部或者全身免疫反應(yīng)，促進炎癥反應(yīng)介導腫瘤發(fā)生；同時，腸道菌群也能增強免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的潛力。

1.2 腸道微生物與免疫治療 免疫治療通過激活人體自身免疫機制殺死腫瘤細胞，其中免疫檢查點抑制劑（ICIs）即阻斷特異性免疫檢查點CTLA-4 和PD-1/PD-L1 的單克隆抗體（mAbs），其通過活化T細胞（輔助T 細胞和細胞毒性T 細胞）及TCR 共刺激信號增強抗腫瘤免疫效應(yīng)發(fā)揮療效[10]，其在惡性黑色素瘤、非小細胞肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等效果持久[11,12]。免疫檢查點抑制劑同時也阻斷了免疫自身耐受導致免疫相關(guān)不良反應(yīng)，尤其是免疫性結(jié)腸炎[13]。此外，有報道證實免疫檢查點抑制劑可加速腫瘤進展[14，15]。有研究比較了接受PD-1 抑制劑治療的非小細胞肺癌和腎細胞癌患者的腸道菌群，應(yīng)答者糞便中阿克曼菌水平顯著高于無應(yīng)答者，分別移植應(yīng)答者、無應(yīng)答者糞便至無菌或者抗生素處理過的小鼠，接受應(yīng)答者糞便移植的小鼠產(chǎn)生PD-1 抑制劑的抗腫瘤效應(yīng)。同時，通過口服阿克曼菌，可增強PD-1 抑制劑的抗腫瘤效應(yīng)[16]。Maston V 等[17]收集、檢測42 例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的糞便標本，比較應(yīng)答者與非應(yīng)答者腸道菌群組成，發(fā)現(xiàn)菌群組成存在差異性，應(yīng)答者長雙歧桿菌、產(chǎn)氣柯林斯菌、糞腸球菌豐度更高。Gopalakrishnan V 等[18]也在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。Chaput N 等[13]、Dubin K 等[19]在經(jīng)伊匹木單抗治療的研究中均發(fā)現(xiàn)應(yīng)答者糞便樣本中糞桿菌豐度高。上述研究表明，免疫治療除本身影響腸道微生物多樣性外，腸道菌群組成、豐度也影響免疫檢查點抑制劑的療效，且不同免疫治療優(yōu)勢菌存在差異，這為干預(yù)腸道菌群進而輔助免疫治療效果提供了新的視角。

2 腫瘤免疫相關(guān)的菌群干預(yù)方式

2.1 抗生素 抗生素指所有人工制造或自然產(chǎn)生的抑制細菌生長的低分子量化合物。通常用于去除或者預(yù)防人體內(nèi)細菌定植，但存在非特異性，不能針對特定菌株，對腸道菌群有雙重影響。在免疫治療前預(yù)防性抗感染處理，清除有害菌、降低感染風險，可提高CTLA-4 抑制劑效應(yīng)[20]。但是，抗生素可打破宿主菌群平衡，改變腸道微生物組成、降低多樣性，引發(fā)菌群失調(diào)，從而降低ICI 療效?？股氐膽?yīng)用已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)顯著影響腸道微生物群落中AMR 基因的豐度和多樣性[21-23]，大量研究顯示抗生素誘導的菌群失調(diào)在小鼠模型上有負面作用。Derosa L 等[24]研究接受PD-1/PD-L1 抑制劑治療的晚期腎細胞癌和非小細胞肺癌患者，非小細胞肺癌（20%）和腎癌（13%）患者在開始PD-1/PD-L1 治療后30 d 內(nèi)使用ATB 的頻率相似，然而使用抗生素的患者中位生存時間和無進展生存時間明顯短于未使用抗生素者，這可能與抗生素暫時改變微生物群落的組成相關(guān)[25]。聯(lián)合使用廣譜抗生素（氨芐西林+粘菌素+鏈霉素）和亞胺培南（但不包括粘菌素）破壞了CTLA-4特異性抗體的抗腫瘤作用，注射CTLA-4 抗體后微生物群落顯著改變，導致類桿菌相對豐度降低，梭狀芽孢桿菌相對富集[20]。Wang F 等[26]研究中表明，萬古霉素處理組小鼠體重較對照組小鼠減輕，菌群豐度降低，發(fā)生嚴重的結(jié)腸炎。Pierrard J 等[27]研究指出，抗生素的使用可對ICIs 抗癌效果和患者預(yù)后產(chǎn)生負面影響，在ICIs 治療前或者期間必須避免使用抗生素。Pinato DJ 等[28]分析了196 例接受ICI 治療的癌癥患者，發(fā)現(xiàn)免疫治療前應(yīng)用抗生素對患者的總生存率無影響。故進行免疫治療的患者是否應(yīng)該使用抗生素、何時使用抗生素及使用何種抗生素仍存在爭議，需要謹慎的綜合評估。

2.2 糞便微生物菌移植（FMT）糞便微生物群移植是指通過上下消化道途徑，將健康供體的腸道微生物群移植到病患體內(nèi)，以恢復(fù)腸道微生物多樣性的方法[29-32]。FMT 于1958 年治療假膜性小腸結(jié)腸炎被首次報道[33]，近年來因其被成功應(yīng)用于治療難治性或者復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染廣為人知，并逐漸推廣應(yīng)用于腫瘤免疫、炎癥性腸病、代謝系統(tǒng)等疾病[34-37]。研究顯示[20]，接受PD-1 抑制劑治療應(yīng)答患者糞便移植的無菌小鼠與接受無應(yīng)答患者糞便微生物群移植的小鼠相比，PD-1 治療的反應(yīng)有所改善，小鼠體內(nèi)免疫毒性T 細胞增加。多項研究表明，F(xiàn)MT 調(diào)節(jié)胃腸道菌群可明顯改善難治性ICI 相關(guān)性結(jié)腸炎。有研究對ICI 性結(jié)腸炎患者行FMT 治療前后的腸道微生物組分進行分析，發(fā)現(xiàn)阿克曼菌為有益菌株，缺乏梭狀芽胞桿菌對結(jié)腸炎有保護作用。當供體的移植微生物開始定植后，后期出現(xiàn)雙歧桿菌增殖現(xiàn)象，最近的小鼠模型研究中雙歧桿菌被證明可以減輕腸道炎癥。研究中觀察到受試者的CD8+T 細胞密度顯著降低，同時黏膜CD4+Foxp3+增加，這可能是FMT發(fā)揮作用的一種潛在機制[38,39]。移植應(yīng)答者糞菌至無病原體條件下培養(yǎng)或抗生素處理過的小鼠，小鼠腫瘤體積明顯縮小[16]。除此以外，不同菌株的FMT可能抗腫瘤效果不同，如Vétizou M 等[20]發(fā)現(xiàn)類桿菌FMT 組抗腫瘤效應(yīng)更強。FMT 短期內(nèi)不良反應(yīng)事件較少，癥狀輕微，但是缺乏長期安全數(shù)據(jù)評估FMT 的總體風險。FMT 存在通過糞便從供體傳染給受體的固有風險。最近報道的含多藥耐藥菌的FMT導致患者死亡，移植后發(fā)生吸入性肺炎、中毒性巨結(jié)腸致死的報告，說明FMT 雖然發(fā)生致死性事件的風險較低，但在某些人群中發(fā)生風險更高，如高齡、抗生素治療后等[40,41]。當前研究未證實FMT 對免疫功能低下的患者有額外的風險，故多數(shù)學者認為FMT 安全性尚可，然而對免疫治療后患者行FMT 仍需謹慎。

2.3 益生菌、益生元及合生元 益生菌是給宿主帶來健康益處的活的微生物，包括乳酸菌屬、雙歧桿菌屬、腸球菌屬，乳酸桿菌、雙歧桿菌最為常見。攝入益生菌可有效減少結(jié)直腸癌患者致病菌（梭桿菌、消化鏈球菌）的數(shù)量，其主要通過調(diào)節(jié)微生物組成結(jié)構(gòu)、豐富度和多樣性而不是直接與腸上皮細胞相互作用發(fā)揮有益的作用[42,43]。補充益生菌鼠李糖酵母菌GG可以減少微生物過度生長，恢復(fù)黏膜完整性，減少微生物移位[44]。研究表明，口服單一菌株的小鼠的抗腫瘤免疫效應(yīng)顯著提高[16,45]，說明益生菌有改善免疫治療效果的作用。Sivan A 等[46]通過16S rRNA 測序技術(shù)從兩種腸道菌群不同的小鼠糞便中篩出雙歧桿菌，通過給TAC 小鼠灌胃短雙歧桿菌或者長雙歧桿菌，發(fā)現(xiàn)小鼠皮下黑色素瘤生長受抑，并且與PD-1抑制劑聯(lián)合幾乎完全抑制了腫瘤生長，發(fā)現(xiàn)這與CD8+T 細胞激活導致樹突狀細胞功能增強相關(guān)。類似的，Vétizou M 等[20]給接受抗生素或者無菌小鼠灌胃脆弱擬桿菌，誘導T 細胞及樹突狀細胞的成熟，恢復(fù)了對CTLA-4 的應(yīng)答。Frankel AE 等[47]發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑應(yīng)答者富含的擬桿菌可能通過類似免疫機制起作用。Wang F 等[26]利用雙歧桿菌改善了檢查點抑制抗體的毒性。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)益生菌可能會阻礙抗生素使用后微生物群的恢復(fù)[48-50]。益生菌制劑易于培養(yǎng)、方便獲得及使用，但是普遍存在標準化、質(zhì)量控制方向的問題。目前可用的益生菌缺乏多樣性，不同制造商的益生菌配方和劑量差異大，口服的菌株數(shù)量級比本土微生物低3～4 個數(shù)量級，進入腸道后進一步減少，無法與本土微生物群競爭，不能達到預(yù)期的效果?？诜嫔志眯圆?，一旦停止食用，它們很少持續(xù)超過14 d[51]。學者們對于益生菌影響免疫治療的機制尚不清楚，其功效未在臨床實驗中證實，故并不推薦免疫治療中應(yīng)用益生菌。

益生元是一種包括菊粉、低聚果糖（FOS）、低聚半乳糖（GOS）及乳果糖等短鏈碳水化合物，在上消化道中消化，可由腸道微生物群發(fā)酵，選擇性地刺激有益細菌的生長和多樣性，并對宿主健康有積極影響[52-55]。食用菊粉型果聚糖后雙歧桿菌、乳酸桿菌屬相對豐度增加，嗜雙歧桿菌數(shù)量減少（嗜雙歧桿菌是已知致病菌屬）[56-58]。益生元的選擇特異性促進了腸道中已經(jīng)存在的有益菌的生長，從而改變了微生物群組成。然而益生元能否影響其他菌群，是否會被所有個體利用尚不清楚，但它們表現(xiàn)出改變腸道微生物群的潛力。

合生元是益生菌和益生元的混合物，通過益生元刺激腸道中益生菌生長從而提高其效用發(fā)揮作用，目前相關(guān)研究甚少。

2.4 飲食調(diào)節(jié) 人體營養(yǎng)的消化、吸收需要腸道微生物協(xié)助，飲食為調(diào)節(jié)腸道微生物群的重要方式之一。有關(guān)雙胞胎的研究表明[59-61]，遺傳只占觀察到的變異的2%～8%，除了年齡、種群外，不同的微生物群落在很大程度上受環(huán)境因素的影響。微生物組是飲食病理學的關(guān)鍵機制，這些認知現(xiàn)在已被廣泛接受[62,63]。富含纖維的植物性食物（蔬菜、水果、全谷物），低加工食物（精制谷物、添加糖、反式脂肪），蛋白質(zhì)（魚類和豆類）組成的飲食能降低心血管疾病和癌癥的風險、降低總死亡率[64,65]。以植物為基礎(chǔ)飲食和以雜食動物為基礎(chǔ)飲食人群間的腸道微生物群落有顯著差異[64-66]。宏基因組分析發(fā)現(xiàn)，高豐度類桿菌，低豐度普雷沃特菌與飲食中動物蛋白、營養(yǎng)性膽堿和飽和脂肪含量相關(guān)，而富含纖維、單糖和植物源性化合物的植物性飲食與之相反[67,68]。總碳水化合物攝入量的增加與微生物群落多樣性的降低密切相關(guān)，雙歧桿菌數(shù)量增加，而乳酸桿菌、鏈球菌等減少[69]。干預(yù)特定細菌類群會影響下游代謝物，如膳食纖維、菊粉、短鏈脂肪酸等[70-72]。從長遠看，納入上述健康飲食成分有助于減輕全球腫瘤負擔。除了以上特定飲食成分，更需要關(guān)注的是飲食模式與微生物相互作用的有害代謝產(chǎn)物才是促進炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生發(fā)展進而影響免疫治療療效的原因[73]。有益的飲食模式需要長久維持，否則腸道菌群的會被迅速逆轉(zhuǎn)。

3 總結(jié)

免疫檢查點抑制劑在晚期或者轉(zhuǎn)移腫瘤治療上具有重要作用。提高免疫效應(yīng)、減輕免疫不良反應(yīng)、尋找生物標志物是目前研究的方向。隨著人們對腸道菌群在免疫檢查點抑制劑療效、毒性反應(yīng)方面發(fā)揮作用的認識不斷加深，通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善免疫治療效果的研究逐漸增多。然而，腸道菌群組成復(fù)雜，目前研究證實的有利、有害菌株只是其中的小部分，仍有很多未知菌株有待探究。闡明所有菌群組成成分，成分間的相互作用及作用機制，進而篩選、確定、培育出有意義的效應(yīng)菌/微生物群是未來研究的關(guān)鍵。另外，微生物組學因方法的精度局限、評判標準不一導致各個研究結(jié)果產(chǎn)生差異性的問題也亟需解決。隨著未來生物技術(shù)的發(fā)展，收集、測序和分析的標準化流程至關(guān)重要。當前眾多研究以動物模型居多，未來需要更多臨床前模型及人類隊列研究證據(jù)的支持，將其與已知的、新的生物標志物結(jié)合起來的探究更是日后研究的熱點。

值得注意的是，當前僅有抗生素干預(yù)及糞便微生物抑制經(jīng)FDA 批準用于腸道微生物調(diào)節(jié)，F(xiàn)MT 的應(yīng)用效果較抗生素更受到肯定及關(guān)注。但是目前國內(nèi)外對FMT 的實施尚未建立統(tǒng)一的標準方法，導致各類研究中FMT 療效結(jié)果差異性大。未來FMT 標準化亟待解決，包括供體的篩選與管理流程，菌液制備標準化流程，腸道準備與FMT 方式，移植劑量、時機以及腫瘤患者的FMT-MDT 管理。另外自體FMT理論上安全性更高，不存在移植排斥問題，但也可能存在促進惡性腫瘤發(fā)生或微生物群傳播相關(guān)的風險，其可行性需慎重評估。

上述幾種菌群干預(yù)方式均處于探索階段，但都表現(xiàn)出通過調(diào)節(jié)胃腸道菌群影響免疫治療的巨大潛力，國內(nèi)外學者對此持積極且謹慎的態(tài)度。相信未來更多的研究及醫(yī)療機構(gòu)會加快、加深對腸道菌群的研究，進而推進精準腫瘤免疫治療，為惡性腫瘤的治療提供新的思路。