新型冠狀病毒實驗室檢測技術的研究

李 麗

（貴州中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科，貴州 貴陽 550001）

2019 年年底以來，新型冠狀病毒(SARSCoV-2) 感染引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19) 在全球范圍內迅速蔓延。2020 年1月11 日首個新型冠狀病毒基因組序列(Genbank登記號MN908947) 公布，各地區重點實驗室迅速制定了針對新型冠狀病毒感染的標準化實驗室診斷方案，并推薦了合適的引物、探針和熱循環條件。配備了擴增前、擴增中和擴增后標準化分區的實驗室能快速檢測新型冠狀病毒。這為隨后臨床上大量出現的“新型冠狀病毒快速檢測”奠定了基礎，這些檢測技術各不相同，從新型冠狀病毒抗原、抗體、抗原和抗體的組合檢測，到核酸擴增檢測。它們的檢測目標和性能特征也各不相同。實驗室診斷檢測的應用場景包括無癥狀人群篩查、有針對性的高危人群篩查、接觸者調查、臨床診斷、疾病嚴重程度監測、傳染性監測及回顧性全人群篩查等。然而，沒有一種單獨的檢測方法能夠同時滿足上文提到的所有應用場景的需求。在本文中，筆者主要是對新型冠狀病毒實驗室檢測技術的研究進展進行綜述。

1 不同類型樣本的檢測性能

COVID-19 是一種主要攻擊人類或動物呼吸道的病毒感染性疾病。診斷此病時標本的選擇取決于檢測環境、疾病階段及臨床特征。目前臨床上主要是將上、下呼吸道標本的病毒檢測作為診斷新型冠狀病毒臨床活動性感染的主要手段。另外，血清和糞便標本也可用于檢測新型冠狀病毒。

1.1 上呼吸道標本的檢測性能

臨床上常用的上呼吸道標本包含鼻咽拭子、鼻咽吸液、口咽( 咽喉) 拭子、前鼻拭子、中鼻甲拭子、唾液標本等。上述標本除前鼻、中鼻甲拭子和唾液標本可由患者自行采集外，其余標本均需由醫護人員采集[1]。上呼吸道標本可用于早期感染有癥狀或無癥狀活動性呼吸道疾病的臨床診斷。鼻咽部標本，特別是鼻咽部分泌物(NPA)標本是診斷呼吸道病毒感染的首選標本，其對病毒的檢出率最高。但由于在抽吸收集NPA 過程中存在產生氣溶膠的潛在風險，我們不建議在COVID-19 的臨床診斷中收集NPA。鼻咽拭子是一種很好的可替代NPA 的標本，其能夠得出比口咽拭子更可靠的檢測結果[2]。為進一步提高COVID-19 的診斷準確率，鼻咽拭子和口咽拭子結合標本是目前診斷COVID-19 活動性感染最常用的標本類型之一[3]。前鼻、中鼻甲拭子和唾液標本可由患者自行收集，上述標本在醫護人員個人防護裝備供應不足的情況下具有明顯的應用優勢（不需要醫護人員收集）。多項研究表明，用深喉唾液標本檢測呼吸道病毒感染的敏感性可與鼻咽拭子標本相媲美[3-4]。但目前世界衛生組織仍不建議使用唾液標本診斷COVID-19。

1.2 下呼吸道標本的檢測性能

與上呼吸道標本相比，下呼吸道標本具有更高的病毒載量，更有可能產生陽性檢測反應[2]。對于處于COVID-19 病程后期的患者或臨床高度懷疑但上呼吸道標本檢測結果為陰性的患者，建議使用下呼吸道標本診斷其病情[3]。在采集下呼吸道標本時，不建議采集誘導痰。這是因為，進行上述操作的過程中會產生氣溶膠，從而可使醫護人員處于危險中。在適當的環境下( 如通風良好的負壓室)，對于接受閉環機械通氣的重癥患者，可在嚴格遵守醫院感染控制規范的情況下采集其氣管內抽吸物和支氣管肺泡灌洗液進行檢測。

1.3 血液標本的檢測性能

新型冠狀病毒很少能在血液標本中檢測到，血液新型冠狀病毒檢測對COVID-19 臨床診斷的幫助有限[5]。在COVID-19 的急性期，間隔2 ～4周采集的配對血清樣本可用于檢測抗體滴度升高4 倍的情況。然而，血清學檢測不能作為急性新型冠狀病毒感染的獨立診斷依據。

1.4 糞便標本的檢測性能

新型冠狀病毒可存在于COVID-19 患者的糞便中。在發病2 周后，病情越嚴重的COVID-19患者其糞便中出現新型冠狀病毒的可能性就越大[6]。重癥監護患者肛門拭子中發現新型冠狀病毒是導致其死亡的危險因素。對于臨床表現高度可疑但呼吸道標本檢測結果為陰性的患者，糞便標本檢測可作為輔助診斷其病情的手段。

2 實驗室檢測技術

2.1 核酸擴增試驗(NAAT)

NAAT 是診斷COVID-19 的首選技術。在診斷COVID-19 時，采用實時聚合酶鏈式反應法檢測上呼吸道標本中的新型冠狀病毒RNA 是首選的初步診斷試驗。目前，環介導等溫擴增(LAMP)和CRISPR 等其他NAAT 技術也已在新型冠狀病毒的檢測中得到應用。進行新型冠狀病毒NAAT檢測時檢測目標是新型冠狀病毒的核衣殼(N)、包膜(E)、刺突(S) 基因和RNA 聚合酶基因。在進行相關檢測時，理想情況下應選擇兩個獨立的基因靶點，因為單靶點檢測的性能可能會受到病毒突變的影響。在對疑似COVID-19 患者進行新型冠狀病毒NAAT 檢測時，樣本- 應答檢驗是否優于標準分子檢驗尚無強有力的證據，建議檢驗人員可結合資源供給、樣本量大小和所需的周轉時間選擇相應的檢驗方法。

2.2 抗原檢測

抗原檢測法（基于免疫技術采用不同的檢測方法，如橫向流動夾心免疫分析法、微流體免疫熒光分析法和色譜數字免疫分析法）可檢測出呼吸道標本中新型冠狀病毒的蛋白。該檢測方法易于操作，可用于床旁檢測(POCT)，因此也被稱為快速診斷試驗（可以在15 ～30 min 內獲得檢測結果）。病毒核衣殼蛋白是最常用的抗原檢測靶點，因為它在臨床樣本中的含量最豐富且不涉及靶蛋白擴增。據報道，進行上述抗原檢測的特異性很高(＞97%)[7]。與需要特殊設備的NAAT 檢測相比，抗原檢測的優點是操作簡單。世界衛生組織建議在無法獲得NAAT 檢測相關設備或周轉時間延長影響臨床使用的情況下（在患者出現相關癥狀后的第5 d ～第7 d 內）可采用抗原檢測法檢測新型冠狀病毒。

2.3 抗體檢測

非定量抗體檢測在流行病學調查中非常重要，它可以確定特定人群的發病率，可以檢測抗體滴度的變化。有研究指出，抗體檢測可在急性新型冠狀病毒感染的診斷中發揮重要作用。抗體檢測通常是針對核衣殼(N)、刺突(S) 蛋白這兩種抗原。在實驗室抗體檢測中，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和化學發光免疫試驗(CLIA) 是最常用的檢測技術。此外，橫向流動免疫分析、膠體金或熒光標記技術也是常用的檢測技術。在進行相關檢測前，應了解各檢測技術的性能特點，并進行內部驗證檢測。進行抗體檢測通常是檢測IgG、IgM、IgA 等抗體、總免疫球蛋白或上述抗體的各種組合。一般來說，IgG 抗體或總免疫球蛋白檢測的準確性高于IgM 抗體、IgA 抗體或IgM/IgG 抗體檢測的準確性。為了提高血清學抗體檢測的準確性，美國疾病控制與預防中心提出了兩步檢測法，即對兩種不同的抗體進行檢測，若首次檢測陽性，就通過對另一種抗體的檢測來進行復核。在新型冠狀病毒感染后的最初幾天到幾周內，進行血清學抗體檢測通常無法檢出相關抗體，故此檢測方法在新型冠狀病毒感染急性期診斷中的應用價值十分有限。但在患者出現癥狀3 ～4 周后進行血清學抗體檢測的準確性較高。

3 檢測性能和結果分析

在美國，從上呼吸道標本中檢測新型冠狀病毒RNA 被認為是初步診斷COVID-19 的首選檢測方法[4]。在無法進行NAAT 檢測的情況下，抗原檢測可作為最初的檢測。但如上文所述，抗原檢測的敏感性低于NAAT 檢測，若臨床可疑患者的抗原檢測結果呈陰性，則應進行NAAT 檢測予以確認。NAAT 檢測陽性一般可確診為COVID-19。在患者出現癥狀后數周內持續檢測新型冠狀病毒的RNA，可檢測到非活病毒片段（無傳染性）[8]。NAAT 檢測結果可能出現假陰性，可考慮在初次檢測24 ～48 h 后進行復檢，特別是有下呼吸道感染證據時可保存下呼吸道標本，以供復檢。建議在出具實驗室檢測結果時要謹慎。當檢測結果與臨床表現不符時，或NAAT 檢測結果呈弱陽性、Ct 值高或溶解曲線異常時，應重新取樣復檢。復檢可通過替代NAAT 檢測進行，若兩種不同檢測的結果矛盾時應尋求參考其他實驗室檢查結果予以確認。檢測結果為陰性時并不一定能排除感染[9]，導致假陰性結果出現的原因可來源于分析前步驟（如標本采集不當）、分析中步驟（如PCR 抑制或靶基因突變）或分析后步驟（如轉錄錯誤等）[10]。

4 小結

當前全球COVID-19 疫情非常嚴峻，準確地診斷COVID-19 對其傳播的遏制和臨床管理而言至關重要。目前診斷COVID-19 的金標準仍然是采用NAAT 技術檢測呼吸道標本中的新型冠狀病毒，但在資源匱乏地區此方法的應用受限。在此類地區，可嘗試采用抗原和抗體檢測替代NAAT 檢測，但應意識到其局限性。綜上所述，筆者認為研究硬件要求低、周轉時間快和檢測性能良好的新診斷技術對控制COVID-19 的流行而言十分重要。