月泰貼臍片影響宮寒血瘀型腎虛不孕大鼠生育功能實驗研究

詹燕珊 劉銳萍 羅 璽 覃楚悅 時 軍,2*

1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省局部精準遞藥制劑工程技術研究中心，廣東 廣州 510006

隨著社會壓力增大，生育年齡推遲，職業緊張度增加，女性的生育能力面臨嚴峻的挑戰，不孕不育發病率也呈現逐年上升的態勢。根據中國第二次不孕不育患病率大規模調查，不孕不育的發生率為18%[1]。中醫認為，宮寒血瘀腎虛型不孕癥是由于腎陽不足、溫補不足、氣血瘀滯而導致的腎陽虛狀態，導致臟腑生理功能受到抑制，子宮內生態環境低下[2]。如婦科名醫羅元愷教授認為排卵障礙所致不孕者多屬腎陽虛衰，病機關鍵為腎之陰陽消長轉化異常[3]。在各臟腑中，腎與女子不孕癥關系最為密切。若先天稟賦不足，房勞多產或過于勞累等，使腎虛血虧；而腎又為五臟陰陽之本，腎氣虛推動無力，致宮寒血瘀，均可影響沖任，使腎虛不能攝精成孕[4]。

月泰貼臍片是選用延胡索、肉桂、細辛、當歸、小茴香等中藥組方而成，為深褐色藥片，具芳香氣味，外用于患者臍部(神闕穴)，每日1次，1次1貼；具有理氣、止痛、活血化瘀和溫經散寒的功效作用[5]，臨床用于治療宮寒血瘀引起的痛經、不孕等。為進一步揭示該方的作用機制，我們觀察了該方對腎虛不孕癥大鼠中血清促排卵(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)水平的影響，以期為其防治宮寒血瘀型腎虛不孕證提供科學數據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SD大鼠(SPF級，90只，雌性60只，雄性30只，體重220～250 g，南方醫科大學實驗動物管理中心提供，合格證號：SCXK(粵)2016-0041。

1.2 試劑 羥基脲(批號：A13GS144627，上海源葉生物科技有限公司)，血清促排卵素試劑盒(批號：E-EL-R0391c)、黃體生成素試劑盒(批號E-EL-R0026c)、雌二醇試劑盒(批號：E-EL-0152c)均購自Elabscience。無水乙醇(批號：100092683)、二甲苯(批號：10023418)均購自國藥集團化學試劑有限公司，HE染液套裝(批號：G1003，Servicebio)，中性樹膠(批號：10004160，國藥集團化學試劑有限公司)；月泰貼臍片(批號：210301，煙臺榮昌制藥股份有限公司)

1.3 儀器 K3 TOUCH酶標儀(Thermo Fisher Scientific)；TGL-16R離心機(珠海黑馬醫學儀器有限公司)；LRH-250生化培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；Donatello脫水機(DIAPATH)；JB-P5包埋機(武漢俊杰電子有限公司)；RM2016病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)；JB-L5凍臺(武漢俊杰電子有限公司)；KD-P組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)；Giotto染色機(DIAPATH)；GFL-230烤箱(天津市萊玻瑞儀器設備有限公司)；Nikon Eclipse E100正置光學顯微鏡(日本尼康)。

2 方法

2.1 模型制備、干預方法及取材 腎虛不孕模型制備參照文獻方法[6,10]，模型組及藥物高、中、低劑量組大鼠每日早晨均給羥基脲(450 mg/kg)灌胃，持續15 d。腎虛模型建立標準：拱背，活動少，反應慢，體毛稀疏不亮，脫毛明顯，肌肉松弛無力，食量減少。

在給大鼠灌胃的同時，對各組給予相應處理：隨機將60只大鼠分為模型組(12只)，月泰貼臍片高、中、低劑量治療組(各12只)，正常組(12只)。按照月泰貼臍片藥品說明書0.55 g/(d·人)為標準，按照體表面積劑量換算法計算大鼠給藥劑量。

選取大鼠臍部，標記(定位：神闕穴)，參考實驗用大鼠經穴定位：臍部神闕穴位于腹部、胸劍聯合與恥骨聯合連線上8/13與下5/13位置處(胸劍聯合下44 mm)[7]。將大鼠臍部局部剪去鼠毛，臍部給藥后，使用醫用創口貼外敷固定藥物。高劑量組給予0.99 mg/(kg·日)；中劑量組給予0.495 mg/(kg·日)；低劑量組給予0.2475 mg/(kg·日)；正常組給予蒸餾水灌胃；模型組不進行額外干預。期間各組動物均正常飲食，自由飲水。第11天，各組雌鼠與雄鼠按比例2∶1[8]同籠4 d制備妊娠模型，第15天取出合籠的雄鼠，繼續飼養7 d后，無菌條件下處死取血清，測定血清促排卵素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2);取得子宮，用10%多聚甲醛固定，后續選用HE染色法觀察子宮組織的形態學改變。

2.2 觀察指標及檢測方法

2.2.1 觀察指標 觀察大鼠活動形態、毛發光澤、活動頻率、納食情況、大小便等。

2.2.2 大鼠受孕率 受孕率=受孕大鼠數/大鼠總數×100%[公式(1-1)]。

2.2.3 使用ELISA法檢測各組雌鼠性激素含量 包括血清促排卵素、黃體生成素、雌二醇的含量。給藥23 d后，所有組別的大鼠，均腹腔靜脈取血，操作過程中使用不含內毒素的無菌試管，收集大鼠血清樣品，依據說明書進行檢測，并求出待測大鼠血清中相應激素的濃度。

2.2.4 常規子宮組織樣本病理學研究 處死大鼠，收集子宮，固定于10%多聚甲醛，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察子宮組織的病理變化。

3 結果

3.1 月泰貼臍片對腎虛不孕模型大鼠一般情況的影響 正常組大鼠毛發油亮順滑，活動靈敏，進食飲水及二便均正常。采用羥基脲灌胃15 d制備腎虛不孕模型后，模型組大鼠出現背部拱起，持續性萎靡不振，蜷縮少動，反應遲緩，體毛黯淡無光澤，進食量減少等腎虛癥狀。高劑量組可以減輕上述腎虛癥狀。

3.2 月泰貼臍片對腎虛不孕模型大鼠妊娠率的影響 正常組雌鼠在自由同籠法[8]同籠4d后受孕率可達100%。模型組受孕率為零，月泰貼臍片高中低給藥組相比模型組可不同程度提高受孕率。結果見表1。

表1 各組大鼠受孕率比較

3.3 月泰貼臍片對各組大鼠血清FSH的影響 對大鼠血清中FSH含量進行測定，由圖1可知，模型組FSH含量降低，和正常組比較有一定差異性(P<0.05)，證明模型組造模成功；與模型組比較，月泰貼臍片高劑量組對FSH表達有提高作用(P<0.05)，差異具有統計學意義。

L：低劑量組；M：中劑量組；H：高劑量組；X：模型組；K：正常組；與模型組比較，*P<0.05

3.4 月泰貼臍片對各組大鼠血清LH的影響 對大鼠血清中LH含量進行測定，由圖2可知，模型組LH含量降低，和正常組比較有差異性(P<0.05)，證明模型組造模成功；與模型組比較，月泰貼臍片高劑量組對FSH表達有提高作用(P<0.05)，差異具有統計學意義。

L：低劑量組；M：中劑量組；H：高劑量組；X：模型組；K：正常組;與模型組比較，*P<0.05

3.5 月泰貼臍片對各組大鼠血清E2的影響 測定大鼠血清中E2含量，由圖3可知，模型組E2含量降低，和正常組比較有差異性(P<0.05)，證明模型組造模成功；與模型組比較，月泰貼臍片高劑量組對E2表達有提高作用(P<0.05)，差異具有統計學意義。

L：低劑量組；M：中劑量組；H：高劑量組；X：模型組；K：正常組；與模型組比較，*P<0.05

3.6 月泰貼臍片對腎虛不孕模型大鼠子宮形態的影響 肉眼觀察，可以觀察到正常組大鼠子宮較厚，顏色鮮紅，血管豐富；模型組子宮小，內壁薄，色澤蒼白發黃；與模型組比較，月泰貼臍片給藥組子宮形態均有不同程度的改善，且高劑量組可達到正常組相近水平，子宮血液循環較為順暢，血流量較多。

光學顯微鏡下可見，正常組子宮內膜細胞排列緊密，固有層子宮腺豐富，卵泡發育良好，卵泡數目多，膠原豐富，結構緊密，間質細胞呈類圓形，肌層肌纖維排列緊密。與正常組比較，模型組子宮內膜上皮呈現不規則凹陷，且子宮肌層較薄，常見一些閉鎖卵泡和原始卵泡，幾乎不見成熟卵泡。高劑量組局部內膜上皮細胞增生，上皮增厚，子宮腺數量增多，卵泡發育較好，膠原增多，結構較為緊密，間質細胞數量增多，局部密度增大。中劑量組子宮內膜上皮較為均勻，間質細胞數量均勻增多，密度略增大，卵泡數量相比正常組較少，原始卵泡較多。低劑量組相比正常組卵泡數量較少，子宮病理形態改善情況不明顯。如圖4。

4 討論

中醫學認為腎者主水，受五臟六腑之精而藏之。即腎藏精，主生殖，為生命之源，元氣之根，而精作為構成人體的物質基礎，腎氣充，才能使生殖之精成熟，陰陽之精相合，從而孕育胎兒[9]。根據當代中醫研究報道，在正常排卵和孕育中，腎精的作用機制，可類比于現代醫學“下丘腦-垂體-卵巢-子宮軸”中下丘腦的作用[10]，其功能紊亂會導致性腺軸激素分泌不足，是造成不孕的常見誘因[11]。因此通過調節機體性激素，可以促進輸卵管卵泡發育，促進胚胎著床，提高受孕率。

圖4 月泰貼臍片對腎虛不孕模型大鼠子宮形態的影響圖(HE，×200)

月泰貼臍片由醋延胡索、肉桂、細辛、當歸、小茴香等藥物組成。方中君藥醋延胡索具活血行氣止痛之功[12]；臣藥肉桂和細辛可補火助陽、散寒止痛、活血調經，共達強腎培陽的功效，使胞宮得以濡養溫煦[13-14]；當歸、小茴香補血調經、活血行氣以補腎活血化瘀[15-16]。諸藥合用，既能補腎暖宮，止痛化瘀，又各司其職，并行不悖，使寒凝血瘀的子宮和虛寒的腎臟得以恢復其精氣。

研究中采用羥基脲灌胃制備宮寒血瘀型腎虛不孕大鼠模型，模型大鼠出現持續性萎靡不振，背毛不整，毛色不光亮不光潔，食少納呆，飲水增多，大便增多，糞質變稀軟，反應遲緩，扎堆趴窩等現象，符合宮寒血瘀癥狀，且模型組受孕率為零，提示宮寒血瘀型腎虛不孕大鼠模型制備成功。在大鼠臍部黏貼月泰貼臍片，可改善上述癥狀，并提高大鼠受孕率。基于病理學結果，提示月泰貼臍片治療宮寒血瘀型大鼠的形態學基礎與改善子宮的病理形態密切相關，包括促進子宮內膜增生，增加子宮內卵泡數量，促進卵泡成熟等子宮形態改變，從而改善胚胎著床環境。研究表明，對于宮寒血瘀模型大鼠，月泰貼臍片可改善其子宮內膜形態，這和性腺軸激素(FSH、LH、E2)等變化有著緊密聯系。月泰貼臍片高劑量組和模型組相比，可提高大鼠中FSH、LH、E2的含量，提示月泰貼臍片通過提高性激素含量以促進胚胎著床，提高受孕率。