基于UPLC-Q-Executive Orbitrap MS技術的藏藥細葉亞菊的化學成分分析

謝雨宸 鄒雪梅 李紅穎 仁真旺甲 李慧林 范 剛* 張 藝

1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137；2.成都中醫藥大學民族醫藥學院，四川 成都 611137

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜(UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS)具有高質量精度、高靈敏度、高分辨率的特點，對藥用植物中的復雜化學成分具有很強的分辨能力，可實現快速鑒別[5]。因此，本研究擬采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術對細葉亞菊的化學成分進行全面分析，為明確其藥效物質基礎和建立質量控制方法奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 VanquishTM， 超高效液相色譜儀(美國Thermo-Fisher公司)，Q-Exactive Orbitrap高分辨質譜儀(美國Thermo-Fisher公司)，Sartorius BSA124S型電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)，Compound Discoverer 3.0工作站(美國Thermo-Fisher公司)，CQ-250超聲清洗器(上海必能信有限公司)，TDZ5-WS臺式低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

1.2 材料 色譜級乙腈和甲醇購于美國Fisher公司；色譜級甲酸和分析級甲醇試劑購于成都市科隆化學品有限公司；水為屈臣氏蒸餾水。細葉亞菊藥材采自四川省阿壩州若爾蓋縣班佑鄉，經成都中醫藥大學龍飛老師鑒定為菊科亞菊屬細葉亞菊Ajaniatenuifolia(Jacq.) Tzvel.的干燥地上部分。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 取細葉亞菊粉末約1 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，精密加入純甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，離心(11000 r/min，10 min)，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2 色譜條件及質譜條件 色譜條件：Agilent Eclipse Plus C18柱(4.6×100 mm,1.8 μm)；流動相：甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B)；梯度洗脫程序(0～10 min，8%～15%；10～25 min，15%～30%；25～35 min，30%～45%；35～45 min，45%～65%；45～50 min，65%～80%；50～55 min，80%～95%)；流速0.3 mL/min；柱溫30℃；進樣量2 μL。

質譜條件：采用HESI離子源，正、負離子模式檢測，正離子檢測模式，噴霧電壓+3500 V；負離子檢測模式，噴霧電壓-3000 V，鞘氣流速35.0 Arb，輔助氣流速10.0 Arb，毛細管溫度320 ℃；采用Full MS/dd-HRMS2掃描模式，Full MS分辨率70000，dd-HRMS2分辨率17500，掃描范圍m/z 100～1500。

2.3 數據處理及分析 按照2.2項下色譜、質譜條件進樣，將原始數據導入Xcalibur 2.0軟件進行擬合，以實際測得的相對分子質量與理論相對分子質量二者偏差<5×10-6的原則，確定各色譜峰對應化合物的分子式，并與Compound Discover 3.0化合物分析鑒定軟件和自建本地庫mzCloud和mzVault相匹配，初步對高分辨質譜下獲取的各成分進行前期推測，再通過相關參考文獻、PubChem、SciFinder等數據庫提供的相對保留時間及高能碰撞下產生的碎片離子信息，進一步對細葉亞菊所含化學成分進行準確定性分析。

3 結果與分析

采用UPLC-Q-Executive Orbitrap MS技術對細葉亞菊供試品進行正、負離子掃描，獲得正負離子流圖如圖1。本文共鑒定出35個色譜峰，其中包括16個黃酮類、5個萜類、5個香豆素類、6個有機酸類及3個其他類化合物。結果見表1。

(A)正離子 (B)負離子圖1 細葉亞菊的正離子(A)和負離子(B)模式總離子流圖

表1 細葉亞菊在正負離子模式下化學成分鑒定結果

表1(續)

表1(續)

3.1 黃酮類成分的鑒定 研究從細葉亞菊中共鑒定出16種黃酮類成分，主要包括黃酮苷、黃酮醇兩種類型。黃酮苷類化合物的結構特點主要是與葡萄糖或鼠李糖等形成氧苷，在質譜高能碰撞下，連續斷裂苷鍵，丟失糖基，生成高強度的黃酮苷元碎片，二級黃酮苷元質譜主要裂解方式有-CO、-CO2、C2H2O、H2O等中性離子的丟失以及黃酮苷元自身發生RDA裂解。以化合物15山奈酚-3-O-蕓香糖苷為例，保留時間為18.85 min，在正離子模式下，準分子離子為[M+H]+m/z 595.1656，經Xcalibur 2.0擬合分子式為C27H30O15，在高能碰撞離子作用下獲得主要二級碎片離子信息為m/z 449.1069、287.0544、153.0180，分別對應[M+H-C6H10O4]+、[M+H-C6H10O4-C6H10O5]+、[M+H-C6H10O4-C6H10O5-C8H6O2]+碎片離子。根據該化合物的精確相對分子質量、斷裂方式，并與文獻報道進行比對后，最終確定該化合物為山奈酚-3-O-蕓香糖苷，其質譜裂解途徑如圖2。

圖2 山奈酚-3-O-蕓香糖苷裂解途徑圖

3.2 萜類化合物成分的鑒定 細葉亞菊中共鑒定出5種倍半萜類化合物，其中有4種化合物為倍半萜內酯，分別為化合物11、14、22和35。以化合物35-1,10β-epoxyachillin為例，保留時間為49.50 min，闡述其質譜裂解規律。在正離子模式下的準分子離子峰為m/z 263.1276[M+H]+，根據精確相對分子質量可確定其分子式為C15H18O4，在正離子二級質譜的碎片峰中給出m/z 245.1166、m/z 235.1326，分別對應[M+H-H2O]+、[M+H-CO]+碎片離子。通過與文獻數據比對，確定該化合物為1,10β-epoxyachillin，二級質譜圖及可能的裂解途徑如圖3。

圖3 1,10β-epoxyachillin裂解途徑圖

3.3 香豆素類成分的鑒定 在細葉亞菊中共鑒定出5種香豆素類成分，香豆素類化合物是以苯駢α-吡喃酮為母核的衍生物，在苯環上常連有羥基、甲氧基、吡喃環、呋喃環等取代基。最大質譜特征是吡喃酮環失羰基，常丟失如-CH3，-CO，-OH 等碎片。以化合物10濱蒿內酯為例，保留時間為21.51 min，正離子模式下經一級質譜掃描得到準分子離子m/z 207.0653[M+H]+，二級質譜產生的碎片離子主要有m/z 192.9733、164.9780、179.1422、151.1478、163.1113，分別對應[M+H-CH3]+、[M+H-CH3-CO]+、[M+H-CO]+、[M+H-2CO]+、[M+H-CO2]+碎片離子。經與文獻比對，該化合物與文獻中二級質譜離子碎片信息一致，故鑒定為濱蒿內酯。濱蒿內酯正離子模式下的裂解途徑如圖4。

3.4 有機酸類成分的鑒定 研究從細葉亞菊中共鑒定了6個有機酸類化合物，以化合物6 綠原酸為例，保留時間為18.30 min，在負離子模式下形成準分子離子m/z 353.0863[M-H]-，經軟件擬合得到其分子式為C16H18O9；在二級質譜中產生的碎片離子主要有m/z 191.0556、179.0350，分別對應[M-H-C9H6O3]-、[M-H-C7H10O5]-碎片離子。根據文獻報道，確定化合物為綠原酸，其裂解途徑見圖5。

圖4 濱蒿內酯裂解途徑圖

圖5 綠原酸裂解途徑圖

3.5 其他類成分的鑒定 實驗還從細葉亞菊中鑒定出3種其他類化合物，分別為腺苷、香草醛和丁香酚。以化合物4腺苷為例，為核苷類化合物，保留時間6.92 min，此類化合物易丟失H2O、NH3等碎片離子，正離子模式下可見其準分子離子峰[M+H]+m/z 268.1035，二級質譜圖可見其先后產生m/z 136.0616[M+H-C5H8O4]+，m/z 119.0352[M+H-C5H8O4-NH3]+的碎片離子，結合參考文獻推斷其可能為化合物腺苷。

4 討論

研究對細葉亞菊提取物在質譜正負離子模式下進行掃描及初步分析，結果表明各成分在正負離子模式下的響應強度具有明顯差異。因此，本研究按照各成分的理化性質結合其在不同掃描模式下的質譜響應優劣，最終選擇了響應最佳時的離子模式作為檢測條件，使各待測物具有較好的響應值和峰形，能夠滿足快速、準確的定性要求。

研究首次采用具有高分辨率的UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS定性技術全面分析了藏藥細葉亞菊中的化學成分，結合文獻報道及化合物的質譜裂解規律，共鑒定了35種化學成分，包括已有文獻[3]報道的槲皮素、木犀草素、綠原酸和金腰乙素，并首次鑒定出濱蒿內酯、柳穿魚黃素、橙皮內酯、東莨菪內酯、三葉豆苷、薊黃素等19種化學成分，這些研究結果可為細葉亞菊藥材的質量控制及其藥效物質基礎研究提供參考。然而，由于質譜數據庫不完整、細葉亞菊基礎研究薄弱缺乏參考數據等原因，仍然有18個主要色譜峰(保留時間分別為10.02 min、15.00 min、15.08 min、17.00 min、18.08 min、21.48 min、23.48 min、25.78 min、30.50 min、33.40 min、36.98 min、41.00 min、41.40 min、44.00 min、44.80 min，45.50 min、46.54 min、48.00 min)未得到準確的鑒定。因此，今后應結合制備型高效液相色譜、二維核磁共振等技術，加強細葉亞菊藥材的化學成分分離及分析研究工作，促進其質量控制及開發利用。