美洲大蠊飲片、標準湯劑、中間體、配方顆粒的HPLC特征圖譜相似性研究

張 悅 高 晗 吳清雨 李軍山,3,4 王亞濤 曾永禎 董博宇 張睿智 孫福仁*

1.北京市平谷區市場監督管理局檢驗檢測中心，北京 101200；2.神威藥業集團有限公司,河北 石家莊 051430；3.楚雄神威施普瑞藥物研究有限公司,云南 楚雄 675000;4.云南省中藥配方顆粒工程研究中心,云南 楚雄 675000

美洲大蠊為蜚蠊科昆蟲美洲蜚蠊Periplanetaamericana(Linnaeus) 的干燥全體。夏季捕捉或人工飼養。本品咸，寒。入心、肝、脾、腎經。可健脾消疳、活血通脈、利水消腫、斂瘡生肌。用于脅痛、癥瘕、疳積、心悸、氣喘、水腫。外用治水火燙傷、各種創傷及潰瘍[1]。分布廣泛，全國各地均有[2]。已知的化學成分主要有蛋白質、脂肪酸、核酸、多糖、信息素、昆蟲神經肽、異黃酮、表皮生長因子等[3-7]。

美洲大蠊藥材中已分離鑒定出含有肌苷、腺苷、尿嘧啶、次黃嘌呤等嘌呤類成分[8]，并建立相應的含量測定方法[9]。美洲大蠊因其具有顯著的組織修復、抗腫瘤、增強免疫力等功效，已被加工制備成多種劑型[10]，如美洲大蠊提取物、配方顆粒等。有研究[11]對美洲大蠊提取物C11-3指紋圖譜分析，確定11批提取物共有峰為21個，相似度大于0.90。美洲大蠊配方顆粒特征圖譜中呈現7個特征峰，以尿嘧啶、酪氨酸、次黃嘌呤、肌苷對照品標定了7個特征峰中的4個[12]。尚未有美洲大蠊飲片、標準湯劑、中間體、配方顆粒相似性研究報道，因此，本文依托HPLC色譜法，以美洲大蠊中嘌呤類成分為分析對象，建立了美洲大蠊飲片、標準湯劑、中間體、配方顆粒特征圖譜，并通過相似度考察進行相似性評價，為美洲大蠊配方顆粒質量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 WATERS Symmetry Shield C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；島津高效液相色譜儀(LC-20AT泵，SPD-M20A型檢測器，SIL-20A自動進樣器，CTO-20AC柱溫箱，島津LabSolutions色譜工作站)；CPA225D型電子分析天平(北京賽多利斯)；JM-A5002型電子天平(余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司)；KH-7200DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；R502B旋轉蒸發儀(上海申科生物技術有限公司)；LGJ-12壓蓋型真空冷凍干燥機(河南兄弟儀器設備有限公司)；榮事達養生藥膳壺(合肥榮事達小家電有限公司)；0.45μm有機系/水系針頭式濾器(ASC，AMERICAN SCIENTIFIC)。

1.2 對照品 尿嘧啶(批號：T14A8X33880，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；尿苷(批號：110887-202104，純度99.6%，中國食品藥品檢定研究院)；鳥苷(貨號：B20905，純度≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司)；次黃嘌呤(批號：DST200305，純度≥98%，樂美天醫藥/德思特生物)；肌苷(批號：140669-202007，純度99.2%，中國食品藥品檢定研究院)；腺苷(批號：AF20122001，純度≥98%，成都埃法生物科技有限公司)。甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)均為HPLC級(美國ACS公司)；水為純化水；其他試劑均為分析純。

1.3 藥材、標準湯劑、中間體與配方顆粒

1.3.1 藥材 10批美洲大蠊飲片來源于云南、四川、安徽、山東4個產區，經原河北省藥品檢驗所孫寶惠老師鑒定，均為蜚蠊科昆蟲美洲蜚蠊Periplanetaamericana(Linnaeus) 的干燥全體。

1.3.2 標準湯劑 根據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》中相關規定，確定美洲大蠊標準湯劑制備工藝為：取飲片100 g，加水煎煮兩次。一煎加8倍水，浸泡30 min，煮沸，保持微沸煎煮30 min，200目篩網過濾，立即冷卻至室溫；二煎加6倍水，煮沸，保持微沸煎煮20 min，200目篩網過濾，合并兩次煎液，立即冷卻至室溫，低溫真空濃縮，濃縮液冷凍干燥，密封包裝，即得。

1.3.3 中間體、配方顆粒 依據標準湯劑含量、出膏率、特征圖譜要求，優化提取參數，確定美洲大蠊配方顆粒制備方法為：取美洲大蠊藥材，切碎，加水煎煮2次，第一次加入10倍量水，煎煮30 min，過濾；第二次向藥渣中加入8倍量水，煎煮20 min，過濾；合并兩次濾液，控制濃縮溫度為55～70 ℃，真空度為0.06～0.09 MPa之間，濃縮至相對密度為1.03～1.05(60℃)，濃縮液噴霧干燥，控制進風溫度為160～180 ℃，出風溫度為80～100 ℃，及時收集干膏粉，即為美洲大蠊配方顆粒中間體，向中間體中加入糊精，補足處方量，混合均勻，干法制粒，制成美洲大蠊配方顆粒。

2 方法與結果

2.1 美洲大蠊飲片、標準湯劑、中間體、配方顆粒特征圖譜建立

2.1.1 色譜條件 WATERS Symmetry Shield C18(柱長為250 mm，內徑為4.6 mm，粒徑為5.0 μm)；以0.25%冰醋酸水為流動相A，以乙腈為流動相B，按下表進行梯度洗脫；柱溫：20 ℃；流速：0.6 mL/min；檢測波長為254 nm。理論板數按肌苷峰計算應不低于5000。

時間/minA/%B/%0～9100→1000→09～10100→980→210～1598→972→315～3597→963→435～6096→884→12

2.1.2 對照品溶液的制備 取尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺苷、肌苷、鳥苷對照品，加水制成每 1 mL含尿嘧啶20 μg、次黃嘌呤30μg、尿苷20 μg、腺苷10 μg、肌苷45 μg、鳥苷15 μg的混合溶液，作為對照品參照物溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

2.1.3.1 美洲大蠊飲片供試品制備 取本品粉末(過二號篩)約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水25 mL(V/V)，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻過濾，濾過，即得[9]。

2.1.3.2 美洲大蠊標準湯劑、中間體、配方顆粒供試品制備 取本品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水25 mL(V/V)，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度 取同一批次美洲大蠊標準湯劑，按2.1.3.2項下供試品制備方法處理，按2.2.1項下連續進樣6次。以肌苷峰為參照物，經計算12個特征峰相對保留時間的RSD 值為0.00%～0.23%，相對峰面積的RSD值為0.00%～1.02%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 穩定性 取同一批次美洲大蠊標準湯劑，按2.1.3.2項下處理，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h時按2.2.1項下進樣，以肌苷峰為參照物，經計算12個特征峰的相對保留時間的RSD 值為0.00%～0.22%，相對峰面積的RSD 值為0.00%～0.94%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.2.3 重復性 取同一批次美洲大蠊標準湯劑6份，按2.1.3.2項下處理，按2.1.1項下依次進樣檢測。以肌苷峰為參照，經計算共有峰的相對保留時間的RSD 值為0.00%～0.28%，相對峰面積的RSD 值為0.00%～2.32%，表明方法的重復性良好。

2.3 樣品測定 取10批美洲大蠊飲片、美洲大蠊標準湯劑、美洲大蠊中間體、美洲大蠊配方顆粒供試品溶液，按2.1.1項下進行檢測，色譜圖如圖1～4所示。

時間/min圖1 美洲大蠊飲片特征圖譜

時間/min圖2 美洲大蠊標準湯劑特征圖譜

2.4 特征峰指認 將采集到的色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012版)選擇平均數法、生成對照指紋圖譜。通過與對照品保留時間及文獻資料比對，確定了標準湯劑特征圖譜中3號峰為尿嘧啶，4號峰為次黃嘌呤，6號峰為尿苷，8號峰為腺苷，9號峰為肌苷，10號峰為鳥苷。如圖5所示。

時間/min圖3 美洲大蠊中間體特征圖譜

時間/min圖4 美洲大蠊配方顆粒特征圖譜

時間/minS1：美洲大蠊標準湯劑；S2：尿嘧啶；S3：次黃嘌呤；S4：尿苷；S5：腺苷；S6：肌苷；S7：鳥苷圖5 美洲大蠊標準湯劑圖譜特征峰指認圖

2.5 相似性分析 將美洲大蠊飲片、標準湯劑、中間體、配方顆粒HPLC對照圖譜進行直觀比較如圖6所示，并導入相似度評價軟件計算相似度。見表1。同時，將10批美洲大蠊飲片、標準湯劑、中間體、配方顆粒HPLC圖譜導入軟件并計算相似度。見表2。結果表明12個特征成分在美洲大蠊飲片制備成標準湯劑、中間體、配方顆粒的過程中得到保留，其中6個成分為尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺苷、肌苷、鳥苷。且通過相似度計算，美洲大蠊飲片、標準湯劑、中間體、配方顆粒對照圖譜相似度在0.90～1.00之間；10批配方顆粒與10批美洲大蠊飲片、標準湯劑、中間體相似度均在0.90～1.00之間。表明美洲大蠊飲片、標準湯劑、中間體、配方顆粒有較好的相似性。

3 討論

3.1 色譜柱考察 本文側重分析了美洲大蠊中水溶性較強的嘌呤類成分，該類成分在常規十八烷基鍵合硅膠色譜柱上分析效果較差。通過篩選，確定了WATERS Symmetry Shield C18色譜柱，該色譜柱可以兼容100%水相系統，同時，極性鍵合基團能夠起到對極性物質的保留作用。故確定使用WATERS Symmetry Shield C18色譜柱。

時間/min

表1 美洲大蠊飲片、標準湯劑、中間體、配方顆粒對照圖譜相似度計算結果

表2 飲片、標準湯劑、中間體及配方顆粒圖譜相似度計算結果

3.2 流動相考察 在流動相選擇上，考察了不同濃度的乙酸水溶液，發現采用0.25%的乙酸水溶液時，特征峰4、5分離度得到改善，高于此濃度時，分離度沒有明顯改善，濃度低于0.25%時，峰4、5分離度較差，確定0.25%乙酸水為水相。通過比較甲醇、乙腈時，甲醇極性更大，更適合水溶性較好的嘌呤類成分，因此，選擇甲醇為有機相。

3.3 柱溫考察 分別設定柱溫為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃，經考察發現，柱溫越低，特征峰4、特征峰5分離度越大，以20 ℃柱溫時，特征峰4、特征峰5分離度達到1.5以上，因此，選擇柱溫為20 ℃較為適宜。

3.4 檢測波長 通過樣品中特征峰全波長掃描波長，發現設定254 nm時，各色譜峰數量、分離度均較好，反映出美洲大蠊嘌呤類成分的多樣性，所以確定254 nm為檢測波長。

3.5 供試品制備方法考察 本文按照《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(送審稿)》中相關要求，以美洲大蠊飲片制備了10批美洲大蠊標準湯劑、美洲大蠊中間體膏粉、美洲大蠊配方顆粒。查閱參考文獻資料，結合標準湯劑、配方顆粒均為水提取，確定美洲大蠊飲片提取溶媒為水[9]；美洲大蠊標準湯劑、中間體、配方顆粒是美洲大蠊飲片經以水溶媒提取、濃縮、制劑而成，通過水、30%、50%、70%甲醇為溶媒進行檢測、比較，以水為提取溶媒時，特征峰面積較大，分離度較好，故確定以水為提取溶媒。超聲處理與回流提取考察，結果顯示超聲提取能夠更好體現美洲大蠊中嘌呤類成分，故選擇超聲提取法。

研究通過美洲大蠊飲片、標準湯劑、中間體、配方顆粒的HPLC圖譜相似性研究，在化學成分上解釋了12個特征峰在美洲大蠊飲片、標準湯劑、中間體、配方顆粒存在相似性，為美洲大蠊配方顆粒質量控制提供數據參考。