藍莓花青素與男性生殖功能損傷機制的研究進展

黃濤 李威 喻英 穆毅 唐開發

1貴州醫科大學（貴陽 550004）；2貴州醫科大學附屬醫院泌尿外科（貴陽 550004）

男性生殖功能障礙是近幾十年才引起臨床及相關研究人員關注的一種疾病。男性生育能力下降的原因離不開氧化應激（OS）與炎癥介質，其中活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）似乎在精子DNA 損傷的產生、精液參數受損和精子功能衰竭中發揮重要作用［1］。近年來，針對OS 及炎癥介質造成的男性不育治療方案和策略層出不窮，而中草藥也逐漸進入人們的視野。本綜述就植物抗炎、抗氧化劑當中較為常見的藍莓花毒素（BA）與OS、炎癥介質的最新研究進展進行綜述，期望為男性生殖功能障礙患者的治療和預后提供幫助。

1 男性生殖功能障礙

男性不育被定義為1年內規律且無保護措施的性交而女方無法懷孕。WHO 調查估計，育齡夫婦不育問題中約50%的病例是由男性引起的。20 世紀80 代以來，流行病學統計結果顯示：整個社會男性人群的精子濃度和總數整體下降，甚至超過半數，下降值分別是52.4%、59.3%［2］。國內的相關研究也表明2001-2018年，健康男性精液的各項參數均隨時間的變化呈現下降趨勢［3-4］。因此，男性生殖功能障礙已成為一個全球性的醫學及社會問題。

造成男性生育能力損害的因素很多，其中包括年齡、體質量、身體成分比例等生理因素；代謝綜合征、感染、炎癥、精子DNA 碎片率（DFI）升高等病理因素；焦慮、創傷、壓力等心理因素；生理活動、吸煙、飲酒、吸毒等生活方式以及暴露于毒素、重金屬、輻射、PM2.5 等環境因素［5-11］。

2 氧化應激及炎癥介質對男性生殖系統的不良影響

2.1 氧化應激對男性生殖系統的影響 男性生殖功能在某些因素作用下將產生極其嚴重的影響，如熱應激會嚴重損害雄性豚鼠的生殖功能，表現為睪丸結構和精子特征的顯著改變，其機制可能是熱應激導致睪丸丙二醛水平升高，GSH-Px、SOD、CAT 等酶的活性降低［12］。當線粒體膜脂質遭受ROS 的侵犯時，將阻礙呼吸鏈電子的傳遞，導致男性生殖功能的病理性改變［13］。此外，男性生殖毒性是順鉑的副作用，其會誘導的睪丸OS 標志物和炎癥介質（TNF-α 和iNOS）發生變化，也可導致凋亡標志物caspase-3 和Bax 的睪丸基因表達增加及Bcl-2 的減少，最終造成男性生殖功能低下［14］。造成男性生殖功能障礙的因素較多，其中ROS 在男性生殖系統疾病的發生發展過程中扮演著重要角色，甚至可以決定男性能否繁衍后代，然而對男性造成的威脅遠不止此。

2.2 炎癥介質對男性生殖系統的影響 炎癥介質是男性不育的核心要素之一，男性生殖系統的炎癥反應會對生殖細胞和細胞內成分造成損傷。鄰苯二甲酸二乙基己酯可以提高血清中TNF-α 和IL-6 水平，進一步造成睪丸中TNF-α、IL-1β 和IL-6的mRNA 表達增加［15］。炎癥介質中的NO 在中高濃度時作為促炎介質誘導OS，從而降低精子活力。在感染、精索靜脈曲張或糖尿病等病理條件下，過量的NO 產生會導致精子毒性，并通過過氧亞硝酸鹽的形成降低精子活力［16-17］。因此，在男性生殖系統遭到損害的因素中，炎癥介質和OS 相互影響，互為因果。

3 BA 對氧化應激及炎癥介質造成男性生殖障礙的改善作用

3.1 BA 在臨床中的相關應用 BA 為漿果藍莓中提取的主要活性物質，是重要的抗氧化物質之一。在肥胖和超重個體參與一項攝入藍莓果實的醫學營養治療研究中發現：參與人員的BMI、胰島素水平、胰島素抵抗、低密度脂蛋白、總膽固醇和尿酸水平在服用藍莓后均顯著下降，而起到關鍵作用的可能就是BA 或者多酚［18］。黃宗銹團隊也選擇了120 名志愿受試者，A 組服用受試物，B 組服用安慰劑，服藥周期35 d，最終結果表明試驗組受試者的視物模糊、眼干澀、癥狀總積分均得到改善、明視持久度提高［19］。此外，以抗氧化和抗炎特性而聞名的BA 成功與水凝膠結合，在受傷的創面應用負載BA 的水凝膠之后，傷口愈合明顯加快，同時也促進了上皮和組織再生和膠原沉積和血管生成［20］。

3.2 BA 可通過干預氧化應激損傷途徑來改善男性生殖功能障礙

3.2.1 BA 可通過促進（和）或增加抗氧化酶以改善男性生殖功能障礙 GSH-Px、SOD、CAT 等三組蛋白酶和非酶系等抗氧化物質作為ROS 清潔劑發揮著巨大作用。在BA 的作用下，酶系和非酶系等抗氧化物質的活性會突顯出來。LOU 等［21］采用藍莓花青素提取物來治療大鼠白內障，結果顯示除了可以提高大鼠晶狀體上皮細胞SIRT1 活性及下調NF-κB 活性，還會增加SOD 和GSH-Px 活性來抑制氧化應激反應。張卓睿團隊［22也證實小鼠肝臟中T-SOD 和GSH-Px 的活性還可以在BA的作用下得到明顯提升，且丙二醛含量降低，總抗氧化能力增強］。藍莓花青素提取物、錦葵素（malvidin，Mv）、錦葵素-3-葡萄糖苷（malvidin-3-glucoside，Mv-3-glc）和錦葵素-3-半乳糖苷（malvidin-3-galactoside，Mv-3-gal）均能降低H2O2，從而降低ROS 和MDA 的水平，并增加人視網膜色素上皮細胞中SOD、CAT 和GSH-Px 的水平來抑制OS［23］。此外，在ALKHALF 等［24］研究中還發現，BA 對輻照所致小鼠血清中SOD 活性的降低也具有明顯的拮抗作用。

酶抗氧化防御系統和非酶抗氧化防御系統作為清除ROS 的第一道防線，催化超氧化物的歧化反應，與CAT、GPX、抗壞血酸過氧化物酶協同作用，有效保護生殖細胞和機體本身。

3.2.2 BA 可通過修復（和）或干預精子DNA 損傷以改善男性生殖功能障礙 精子DNA 的完整性對于遺傳信息的準確傳遞是必不可少的，攜有DNA損傷的部分精子可將遺傳缺陷傳遞于后代，可能導致子代遺傳表觀和特性發生變化。ALKHALF等［24］用BA 對輻照大鼠影響的研究中進行了DNA片段化試驗，該實驗表明在受輻照的大鼠中有大量DNA 斷裂，而補充BA 的大鼠中卻沒有DNA 斷裂，且在輻照期間用BA 處理對DNA 斷裂具有中等保護作用。此外，補充BA 除了影響基因組DNA 甲基化水平外，還通過減少氧化應激、增強抗氧化能力、保護α-TP 代謝和調節基因表達來改善全氟辛酸的毒性效應［25］。通過對Cd 誘導的青春期男性小鼠損傷進行建模并用花青素-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-Glucoside，C3G）喂養，證明C3G 可以挽救精子的數量和活性，也在精子發生過程中表現出對Cd 誘導的組蛋白修飾的部分抗性，并防止了精子核中DNA 的氧化損傷［26］。

精子在產生和成熟的過程中，當修復途徑缺陷時會導致精子的發育停滯和異常重組，最終導致男性不育。因此，DNA 的完整性對精子發育和胚胎的質量來說至關重要，在BA 的干預下，利于DNA 損傷的修復和保護。

3.2.3 BA 可通過拮抗脂質過氧化來改善男性生殖功能障礙

3.2.3.1 BA 可通過保護（和）或修復細胞膜以改善男性生殖功能障礙 人類精子膜中含量較高的多不飽和脂肪酸增加了膜脂質過氧化的敏感性，花青素則能通過優化血清飽和和不飽和脂肪酸的分布，在增強抗氧化防御能力方面發揮積極作用。有關研究［27］表明，C3G 降低了大鼠Leydig 細胞系（R2C）細胞的膜脂氧化和線粒體膜電位的損傷率，上調了類固醇急性調節蛋白表達，促進了膽固醇轉運，最終促進了R2C 細胞中孕酮或睪酮的合成。在矯馨瑤等［28］的研究中發現，BA 除了能增加對·OH、DPPH 自由基、H2O2、O2·及Fe3+等物質的清除率，對脂質過氧化也能起抑制效果。ROS 會主動攻擊存在于精子膜中不飽和脂肪酸的雙鍵，導致脂膜發生氧化損傷，致使精子膜的流動性和完整性受到損害，從而進一步造成精子與卵子識別、融合及信息傳遞等障礙。故而，我們要深入了解BA 在膜脂成分與精子的相關性，這將有助于我們為男性生殖功能障礙的診斷、治療及預后提供新的診療思路及方法。

3.2.3.2 BA 可通過抑制（和）或減弱細胞凋亡以改善男性生殖功能障礙 從胚胎發育的角度來看，細胞凋亡被認為是至關重要的，貫穿于生物體的整個生長過程中，有助于組織的更新和擺脫炎癥細胞，但其卻不可過度凋亡。研究證實了BA 能顯著抑制H2O2誘導的人視網膜色素上皮細胞凋亡，降低血管內皮生長因子水平，并激活Akt 信號通路，激活的Akt 可以作為核因子E2 相關因子2（Nrf2）活化的上游信號，增強escin 介導的視網膜色素上皮細胞抗氧化和對抗H2O2的細胞保護活性［23，29］。藍莓花青素提取物通過抑制衰老和細胞凋亡以及將過表達的血管內皮生長因子（VEGF）下調至正常水平來保護這些細胞免受光誘導的損傷，從而對視網膜色素上皮細胞有益［30］。

細胞存活是機體得以延續的基本條件，當生殖細胞受到損傷時，可在BA 的作用下，通過caspase-3、Akt 等相關信號通路來調節細胞活性，從而改善男性生殖功能。

3.2.3.3 BA 可通過改善（和）或糾正線粒體損傷以改善男性生殖功能障礙 精子線粒體功能的缺陷損害了維持精子運動所需的能量產生，并且可能是弱精子癥的根本原因。ROS 的過量產生與線粒體功能障礙密切相關，其特征是線粒體膜電位的喪失、線粒體質量的增加、線粒體呼吸復合物的改變、細胞色素c 的釋放、線粒體轉錄因子A 的減少和mtDNA 斷裂的增加［31］。在SUN 等［32］研究中發現，丙烯酰胺（AA）和縮水甘油酰胺（GA）（GA 是AA 的最終基因毒性代謝物）暴露增加ROS 水平并降低線粒體膜電位，導致黃體酮產生減少，C3G 則通過抑制ROS 生成、線粒體膜去極化和細胞凋亡以及激活類固醇生成酶，有效降低AA 和GA 誘導的生殖毒性。Bax 是BCL2 家族的成員，當細胞凋亡信號出現時，Bax 的分子結構發生變化，然后線粒體的通透性轉換孔通過與電壓依賴性陰離子通道相互作用，最終線粒體膜遭到損害，而BA 干預下顯著抑制了Bax 和Caspase3 的表達，從而阻礙線粒體遭到進一步的損害［33-34］。

因此，經BA 干預下發現線粒體通透性過渡孔開口減少，總抗氧化應激能力顯著增加，線粒體膜電位的去極化和膜脂質過氧化得到改善，對某些因素誘導的線粒體損傷提供了顯著的保護。

3.3 BA 可通過阻斷（和）或減少炎癥介質以改善男性生殖功能障礙 研究［35］證實了多種炎癥細胞因子如IL-1β 和IL-6 以及PGE2 等相關炎癥介質都會受到BA 的調節作用，從而抑制炎癥細胞產生的ROS。Mv-3-glc 和Mv-3-gal 是BA 重要成分，其可抑制TNF-α 誘導的單核細胞趨化蛋白-1、細胞間粘附分子-1 和血管細胞粘附分子-1 的產生以及IκBα 的降解；不僅如此，Mv-3-glc 和Mv-3-gal 能夠抑制p65（NF-κB 的一個亞基）的核轉位，表明Mv-3-glc 和Mv-3-gal 可以阻斷促IκBα 下游的炎癥信號［36］。XIAO 等［37］研究發現，C3G 可以通過血睪丸屏障抑制炎性細胞因子來改善結腸炎小鼠的精子質量和受損的生育能力，并且相對低劑量（12.5 mg/kg 和25 mg/kg）的C3G 可通過改善結腸炎和降低血清炎性因子水平來減輕炎性因子對睪丸的損害。

在病理和生理過程中，NO、NF-κB、TNF-α、IL-1β 和IL-6 等炎癥介質的反常功能取決于機體的整體狀態和氧化系統-抗氧化系統的平衡。然而，BA 對于炎癥介質的具體作用機制及如何通過簡單檢測來預判男性生殖功能狀態是我們接下來繼續探索的方向之一。

4 總結與展望

綜上所述，BA 可以作為抗氧化物酶類物質或非酶物質改善和緩解ROS 及炎癥介質對精子、生殖細胞及器官的損傷。除了影響基因組DNA 甲基化水平、防止精子核中DNA 的氧化損傷外，還通過減少氧化應激、增強抗氧化能力、保護α-TP 代謝和調節基因表達來改善生殖功能狀態。脂質過氧化時，BA 的生理活性會穩定細胞膜的穩定性和修復損傷的功能，并使線粒體的功能和結構可以得到恢復，保護細胞免受氧化應激的侵襲及凋亡。BA 可調節L-1β、NO、IL-6 以及PGE2 等相關炎癥介質，阻斷炎癥信號通路，直接或間接減少炎癥細胞產生的ROS 來改善生殖系統的損傷。

然而，現階段大部分實驗研究仍停留在動物實驗階段，BA 對男性生殖系統的抗炎、抗氧化作用機理上尚未研究清楚，BA 成分之間的是否存在協同作用以及BA 發揮預期效果所需具體劑量也是未知的。因此，進一步研究BA 對男性生殖功能障礙的具體療效、作用機制、調控網絡及作用靶點是我們接下來的研究重點。