附子多糖研究進展

汝沈圓，高靜東

(南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院，江蘇 蘇州 215000)

附子，又名烏頭，拉丁文名AconitumcarmichaeliDebx.，是毛茛科烏頭屬植物的子根加工品，入藥已有一千多年歷史。《神農本草經》首次記錄了附子，并在書中將其歸為下品，是“大毒不可久服”的藥物[1]。附子性味辛、甘、大熱，有毒，歸心、腎、脾經，主要功能有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛[2]。對于附子的研究目前主要集中在生物堿領域，但由于現代醫學已經報道了植物多糖的許多生物活性，附子多糖的研究也逐漸增加。在過去的十幾年里，人們發現附子多糖具有增強免疫、抗腫瘤、保護心肌細胞等作用[3]，對附子多糖的關注越來越多。本文就近年來附子多糖國內外研究進展進行綜述。

1 附子多糖的結構和提取純化

1.1 結構

多糖是指由糖苷鍵連接的10個或更多單糖形成的高分子聚合物，一般存在于動物、植物及微生物細胞壁中[4]。然而，由于分子量大且結構復雜，多糖的研究一直是個難點。ZHAO等[5]發現附子多糖的結構是α-(1/6)-d-葡聚糖，其平均分子量約為14 000 Da，且主鏈的每4個殘基C-3上都有1個葡萄糖。而YANG等[6]通過一系列理化和儀器分析發現，純化后的附子多糖由d-阿拉伯糖和d-葡萄糖組成，摩爾比為7.5∶92.5，平均分子量為6.29×106Da。這種結構和分子量的差異是由于不同的提取方法所致[7]。

S.MORENO-MENDIETA等[8]通過回顧性研究，闡明了植物或微生物來源的多糖生物活性與其結構相關，它們結構中的α/β-葡聚糖可以通過與特定受體結合來發揮輔助活性，但是不同來源甚至相同來源分離出的葡萄糖聚合物都可能有所不同，生物活性也受到一定影響。

1.2 提取

附子多糖的提取目前主要有熱水浸提法、酶輔助法、微波提取法和超聲法。錢珍[9]和吳娜等[10]皆采用熱水浸提法，但吳娜在原有工藝的基礎上利用反向傳播人工神經網絡(BP-ANN)進行分析和建模，得出最佳提取條件為時間3.5 h，溫度90 ℃，料液比1∶20。朱盛林等[11]和張曉琳[12]分別在附子粉乙醇回流后采取微波輔助和植物復合酶輔助的方法提取多糖，張曉琳認為當溫度為45 ℃、pH=4.5時，用濃度為1.4%的植物復合酶提取1.5 h的結果最佳，為15.77%。而朱盛林等測得當提取時間為10 min、溫度為80 ℃、料液比1∶20時附子多糖的提取率更高，達16.10%。魯靜等[13]將附子粉末加入80%的乙醇中回流，料液比10 mL/g時利用超聲在73 ℃的條件下提取34 min，最后得到的附子多糖平均提取率為19.05%(RSD=0.60%，n=3)，對比其他方法在提取時間和提取率上有一定優勢。

1.3 純化

附子多糖的提取目前已有較多報道，但純化工藝卻研究甚少，方法也大不相同。較為常見的是醇沉法，吳娜等[10]將濃縮后的附子多糖提取液放入80%乙醇中沉淀，過濾后直接干燥得到粗多糖。朱盛林等[11]在醇沉的基礎上用無水乙醇、乙醚清洗沉淀，減少了有效成分在沉淀中的包裹損失。而丁興杰等[14]在醇沉、離心后用Sevage液去除多糖溶液中的蛋白質，反復透析后得到精制多糖，純度達91.89%。

2 附子多糖的藥理作用

2.1 抗腫瘤

2.1.1 誘導癌細胞分化 彭文珍等[15]將人早幼粒白細胞HL-60分別放入加有全反式維甲酸、生理鹽水和附子多糖的不同培養基中，結果發現附子多糖組的細胞核分化增多，部分早幼粒細胞分化為晚幼粒細胞，表明附子多糖對HL-60細胞有誘導分化的作用，且具有促進HL-60細胞朝粒細胞轉化的可能，為臨床應用附子治療人早幼粒白細胞病提供了依據，但具體機制不清。

2.1.2 促進癌細胞凋亡 有研究顯示，腹腔注射或灌胃給藥的附子粗多糖和酸性多糖可以誘導腫瘤細胞的凋亡，從而延長H22和S180荷瘤小鼠的存活時間，發揮抗腫瘤作用[16]。SUN等[17]發現人腦膠質母細胞瘤U87MG細胞在附子多糖硫酸衍生物的作用下生長會受到抑制，并發生凋亡，其背后的原因可能與NF-κB/Bcl-2信號通路有關。而另有研究表明[18]，附子多糖培養48 h可以使H22細胞生存率顯著降低，細胞凋亡明顯增加。對比空白對照組，40 μg/mL的附子多糖大大減少了垂體腫瘤轉化基因1(PTTG1)的轉錄和蛋白質表達，有效降低Akt的磷酸化水平，增加磷酸化P38絲裂素活化蛋白激酶(P-P38 MARK)的蛋白水平。荷瘤小鼠模型展現出相似的數據。在該研究中，PTTG1的表達抑制被證實與附子多糖誘導的細胞凋亡密切相關，與P13/Akt和P38 MAPK信號通路也有一定關系，而既往研究表明許多腫瘤細胞的凋亡、增殖都與P13K/Akt、P38 MAPK通路有關聯性[19-22]。因此我們可以推測，附子多糖可能通過抑制腫瘤轉化基因1來增強P38 MAPK或減弱P13/Akt信號通路，從而達到促進細胞凋亡的效果。

2.1.3 抑制癌細胞的浸潤轉移 MMP-2、MMP-14、TGF-β1是腫瘤浸潤轉移的重要標志。安禎祥等[23]發現附子多糖作用后的胃癌移植瘤裸鼠瘤重顯著降低，胃癌血清TGF-β1含量下降，MMP-2、MMP-14蛋白表達下調，其中200 mg/(kg·d)灌胃的裸鼠MMP-2、MMP-14mRNA表達明顯下降，表明附子多糖可能通過下調MMP-2、MMP-14蛋白及其mRNA 的表達來抑制腫瘤的浸潤轉移，從而達到抑癌效果。ZHANG等[24]通過觀察人乳腺癌MDA-MB-435s細胞經附子多糖及其硫酸衍生物作用后細胞遷移的程度，發現附子多糖(ACP1)及其硫酸衍生物(ACP1-s)可以顯著抑制MDA-MB-435s細胞中肌動蛋白骨架的聚合，降低Vav2的磷酸化，削弱Rac1的激活，而后兩者均為乳腺癌轉移有前景的治療靶點。其中，ACP1-s對MDA-MB435s細胞遷移的抑制作用強于ACP1，說明硫酸化可增強天然多糖對癌細胞遷移的抑制能力，對附子多糖及其硫酸衍生物在抗乳腺癌轉移藥物中的應用有指導意義。

2.2 促進免疫應答激活

2.2.1 誘導抗原遞呈細胞分化和成熟 樹突狀細胞被認為是目前最強的抗原遞呈細胞，且已被證實在抗腫瘤CD8+T細胞的初始交叉啟動中起關鍵作用，在效應T細胞轉運和過繼T細胞治療中也是必需的[25]。因此長期以來，人們一直希望通過增加樹突狀細胞作為促進T細胞效應功能的手段，但接種疫苗或使用樹突狀細胞生長因子等方法容易受到內源性免疫抑制細胞的影響[26]。在此基礎上，有研究發現將外周血單個核細胞放入100 mg/L的附子多糖中培養，3 d后細胞出現分化，10 d后發展為典型的樹突狀細胞形態，CD80、CD83、CD86等共刺激分子表達均明顯提高。與陽性對照組相比，附子多糖誘導的樹突狀結構細胞最大直徑、表面積、樹突數目均無明顯差異，提示附子多糖可以促進樹突狀細胞的分化和成熟，從而活化T淋巴細胞、激發免疫應答[27]，為中藥多糖作為免疫制劑參與抗腫瘤過程提供了可能性。

2.2.2 誘導淋巴細胞增殖 淋巴細胞增殖在免疫反應的激活級聯中非常重要[28]。ZHAO等[29]分別在體外和體內測試了附子多糖作用下刀豆球蛋白(ConA)和脂多糖(LPS)誘導的脾淋巴細胞增殖情況，結果表明附子多糖可以劑量依賴性地促進由特異性有絲分裂原誘導的小鼠T細胞和B細胞的增殖，且當附子多糖劑量在一定范圍內時，可以通過刺激脾臟中分泌抗體的B細胞來促進體內的體液免疫。GAO等[29]選取不同品種的烏頭和藥用部位，分別從中提取多糖，得到以淀粉、非淀粉型α- d葡聚糖和果膠多糖為主要成分的多糖組分。通過給藥環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠模型，發現經多糖處理的小鼠淋巴細胞增殖顯著增強，巨噬細胞被激活，與模型組相比，多糖組的細胞毒性明顯提高。其中，果膠多糖比中性多糖展現出更顯著的抗腫瘤和免疫刺激活性。

2.2.3 促進細胞因子釋放 有研究表明，附子多糖連續灌胃能使H22荷瘤小鼠的胸腺指數、脾臟指數恢復正常，提升白細胞水平[30]。與此同時，給予附子多糖的荷瘤小鼠細胞因子水平(IL-2、TNF-α和IFN-γ)顯著提升，且呈現劑量依賴性，提示附子多糖可能通過促進血清細胞因子的分泌來激活宿主機體的免疫反應，間接發揮抗腫瘤活性。

2.3 其他作用

2.3.1 抑制血管鈣化 氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL)是導致血管鈣化的主要原因之一，陳燕婷等[31]用該種方法制作了人體血管平滑肌細胞鈣化模型，用不同濃度的附子多糖處理并觀察細胞的變化。結果顯示，附子多糖可以使堿性磷酸酶(ALP)的活性降低，骨相關蛋白Osterix、Msx2、BMP2的mRNA表達下調，收縮蛋白SMA的mRNA表達提高，對血管平滑肌細胞成骨樣分化及細胞凋亡有抑制作用。其機制可能是通過降低神經酰胺水平和其代謝酶中性鞘磷脂酶(N-SMase)的活性，調節神經酰胺信號，從而達到抑制血管鈣化的效果。

2.3.2 改善胰島素抵抗 研究發現附子多糖可以增加3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖消耗，對3H-葡萄糖在胰島素抵抗脂肪細胞中的攝取也有促進作用,同時經過附子多糖培養后，胰島素抵抗脂肪細胞跨膜轉運蛋白GLUT4的轉位量顯著提高，但蛋白表達沒有明顯變化[32-34]。因此推測附子多糖可能是通過促進GLUT4轉位，從而增加胰島素抵抗脂肪細胞3H-葡萄糖的攝取，改善胰島素抵抗，但具體機制尚不清楚。另有研究指出，在胰島素抵抗的發展過程中，炎癥是一個重要因素，而由肥胖誘導的組織炎癥被認為是胰島素敏感性降低的主要原因[35]。SU等[36]用附子多糖治療高脂飲食誘導的肥胖(DIO)小鼠，4周后小鼠空腹血糖顯著降低，胰島素敏感性增加，葡萄糖耐量得到改善，DIO小鼠脂肪組織和肝臟以及血清中炎癥細胞因子的表達明顯下降，肥胖小鼠全身炎癥反應有所緩解。提示附子多糖可以作為治療2型糖尿病靶向炎癥的潛在藥物，其機制可能與抑制核因子κB通路的激活，降低IRS-1的絲氨酸磷酸化和恢復PI3K/AKT途徑對葡萄糖的利用等有關。

2.3.3 促進神經元再生和抗抑郁 附子多糖可以增加成年小鼠海馬神經發生并產生抗抑郁效應。YAN等[37]實驗研究表明，對雄性大鼠注射100 mg/kg的附子多糖連續14 d后，附子多糖不僅逆轉了由長期社會失敗壓力引起的回避行為，使社交失敗應激動物相互作用的時間增加，還逆轉了海馬神經發生的抑制，促進神經元的再生。另外，在注射BDNF-TrkB信號通路的trkB抑制劑后，附子多糖給藥誘導的抗抑郁效應和細胞增殖被完全阻斷，表明附子多糖的抗抑郁作用與神經源性效應和BDNF通路相關。

3 結語

附子的有效成分主要是二萜生物堿和附子多糖。二萜生物堿已被證實有抗炎、鎮痛、抗腫瘤等功效[38]，但同時也可引發心臟和神經中毒等不良反應[39]。與之相比，附子多糖在具有眾多生物活性的同時，幾乎沒有不良反應[40]，因此值得進一步研究。從上述報道可以看出，附子多糖抗腫瘤的途徑主要分為兩種，一種是對腫瘤細胞的直接作用，通過誘導分化、促進凋亡和抑制浸潤轉移等方式阻止癌細胞的發展；另一種是間接途徑，通過刺激機體免疫力，增強宿主免疫反應來更好地發揮抗腫瘤效果。但在具體的案例中，附子多糖是通過哪一種途徑抗腫瘤，或兩種途徑同時發揮作用尚不清楚，有待進一步探究。此外，有研究顯示，多糖對腫瘤微環境的免疫治療有積極作用，在增加NK、CTL細胞免疫毒性、激活巨噬細胞、促進細胞因子釋放、降低免疫檢查點表達等多個方面療效顯著[41]。附子多糖具有良好的刺激免疫應答作用，關于附子多糖與免疫治療的關系是一個值得研究的方向。而由于多糖本身分子量大的結構特點，其生物利用度普遍較低。研究顯示，某些多糖可以依靠不被吸收入體內，通過直接影響腸道菌群來抑制宿主腫瘤[42]。腸道微生物群與宿主具有共生關系，在宿主營養、免疫和代謝中起決定性作用，并可調節癌癥治療效果。這也可以解釋為什么植物多糖不能很好地被吸收，但可以抑制腫瘤的生長。在今后附子多糖抗癌機制的研究中，對腸道微生物菌群的影響可以作為一個重要研究方向。另外，現在雖有許多報道證實了附子多糖的抗腫瘤作用，但對其抑瘤的有效劑量區間卻鮮有討論，對附子多糖起效的最大、最小劑量，最佳劑量區間仍不清楚。同時，從以上研究可以發現，附子多糖的純化目前主要停留在粗多糖階段，雖有一些除蛋白和層析方式的報道，但由于步驟繁瑣、效率低下等原因，多數學者仍選擇最簡單方便的醇沉法。但隨著對附子多糖功效的逐步探索，多糖制品的開發是必然趨勢，屆時純化技術或面臨新的挑戰。

近幾十年來，中草藥多糖因其具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂和免疫調節等重要生物活性而備受關注[43]，附子多糖也不例外，但相比黃芪、當歸、甘草等多糖成分，附子多糖的研究仍比較欠缺。為了進一步闡明附子多糖的藥理作用及其作用機制，研究者們還需加強附子多糖的提取純化、構效關系、作用途徑、毒副作用等方面的研究，從而更加明確附子多糖對臨床疾病的治療意義，為附子多糖制劑的開發和臨床應用提供更多依據。