EMT相關信號通路在膠質母細胞瘤中的研究進展

李欣，丁漣沭

(南京醫科大學附屬淮安第一醫院神經外科，江蘇 淮安 223300)

在成人原發性腦腫瘤中，膠質瘤的發病率最高，其中膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)惡性程度最高、侵襲性最強[1]。目前針對GBM的一線治療仍以手術切除為主[2]。對于失去手術機會或已經行腫瘤切除的患者常采用二線治療，即采用放療同時輔以替莫唑胺化療的綜合治療[3]。然而，GBM細胞具有極強的增殖、遷移和侵襲能力，同時又具有高度異質性，且由于存在血腦屏障，患者預后往往不佳，生存期僅為12～15個月，5年生存率只有3%～5%[4]。目前，GBM的發生發展機制尚未完全闡明。因此，探索GBM的發病機制、尋找安全有效的治療方法具有重要意義。

上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)指上皮來源的細胞失去極性而獲得間充質表型的轉化過程，它是上皮細胞獲得遷移能力的有效途徑[5]。近年來，EMT在乳腺癌[6]、肝癌[7]、膀胱癌[8]等腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲過程中發揮重要作用。EMT的過程包含多條信號通路，信號通路之間可以相互協同、相互轉化。EMT與GBM發生發展過程密切相關，微RNA(microRNA，miRNA/miR)可通過相關信號通路誘導GBM發生EMT。現對EMT相關信號通路及相關miRNA在GBM中的研究進展予以綜述，以期為GBM的研究提供理論依據。

1 EMT的概述、分類及其特征

在人體各類正常組織中，上皮細胞依靠各種連接及細胞極性維持完整性。上皮細胞的連接包括緊密連接、縫隙連接、黏附連接以及橋粒。而細胞極性主要來源于不同極性的蛋白復合物。這些蛋白復合物通常定位于細胞頂端和細胞基底外側區域，以此形成細胞頂端-基底端極性基礎。當細胞失去上皮特性，即失去細胞間黏附和極性時就會發生EMT[9]。根據EMT發生的生物學背景，其可分為3種類型： Ⅰ 型EMT與胚胎發育有關，通過EMT實現胚胎發育過程中細胞多樣性；Ⅱ型EMT與傷口愈合和組織再生有關，通過EMT產生纖維細胞進行創傷修復及組織再生； Ⅲ 型EMT與癌癥進展有關，通過EMT而具有遷移及侵襲能力[9]。當上皮細胞激活EMT后，其中的上皮鈣黏素(E-cadherin)轉化為神經鈣黏素(N-cadherin)，而N-cadherin則是間質細胞標志物。這一變化導致上皮細胞由典型的多邊形和鵝卵石形態轉變為紡錘樣的間質細胞形態，因此失去了細胞頂端-基底端極性以及細胞完整性，從而誘導腫瘤細胞的遷移與侵襲[10]。

2 GBM中EMT相關信號通路

2.1轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smad信號通路 TGF-β/Smad信號通路在正常細胞和早期癌中具有生長抑制作用，參與調節多種腫瘤細胞的EMT過程。在腫瘤進展過程中，癌細胞可以選擇性地避開TGF-β的抑制信號，同時保留功能正常的TGF-β受體和Smad系統，從而導致癌細胞黏附能力下降，遷移能力增強[11]。Lamouille等[12]研究發現，TGF-β通過與TGF-β受體1、TGF-β受體2結合，磷酸化下游信號轉導分子Smad2、Smad3，隨后Smad2和Smad3在細胞質中與Smad4結合形成三聚體復合物并進入細胞核，最終激活EMT相關轉錄因子，如Snail家族、ZEB家族和Twist，這些轉錄因子被激活后促進E-cadherin降解和N-cadherin表達，從而誘導腫瘤發生間充質轉化[13]。TGF-β在GBM間充質轉化中發揮重要作用。miR-193b在GBM中高表達，可通過靶向抑制GBM中的Smad3調節TGF-β通路，從而促進腫瘤細胞的增殖[14]。余杰等[15]研究表明，敲低雙腎上腺皮質激素樣激酶1對膠質瘤細胞增殖遷移和侵襲的抑制作用與其抑制TGF-β/Smad信號相關。另有研究顯示，在GBM中高表達的Musashi-2可通過激活轉錄因子Snail和TGF-β/Smad通路正反饋激活EMT，促進GBM的惡性進展[16]。同樣，作為EMT蛋白的Slug可以被TGF-β激活，從而參與GBM中腫瘤血管的形成和血腦屏障的破壞[17]。由此可見，TGF-β/Smad信號通路可通過miRNA和一系列轉錄因子等誘導EMT，從而增強GBM增殖、遷移和侵襲能力。盡管TGF-β/Smad信號通路可以和其他信號通路協同作用維持細胞間質表型，但該協同作用在GBM中尚未研究透徹，因此需要進一步探究TGF-β/Smad通路在GBM中誘導EMT的過程是否有其他通路參與。

2.2Wnt/β聯蛋白(β-catenin)信號通路 Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發育、組織器官形成過程中均具有重要作用。在正常上皮細胞中，Wnt/β-catenin信號通路處于抑制狀態，β-catenin可以直接與E-cadherin結合，α聯蛋白可以與肌動蛋白連接，三者可形成復合物，以維持上皮細胞黏附和穩定。在腫瘤細胞中，Wnt/β-catenin通路參與調控其EMT。作為Wnt/β-catenin信號通路的核心組成成分，激活后的β-catenin可以在細胞核內聚集，從而增強GBM細胞的增殖和侵襲能力并誘導凋亡細胞死亡，而阻斷β-catenin可拮抗其致癌作用[18]。有研究表明，叉頭框轉錄因子C1可結合β-catenin，以增強β-catenin的核移位以及轉錄活性，而叉頭框轉錄因子C1與β-catenin的相互作用是膠質瘤形成的重要因素[19]。此外，盧雅麗等[20]研究表明，過表達β-catenin抑制基因2 可抑制β-catenin的核轉移，使細胞中總β-catenin和活化β-catenin的表達水平明顯降低，而使磷酸化β-catenin的表達水平明顯升高，最終抑制膠質瘤細胞中Wnt/β-catenin信號通路的激活。同樣，信號轉導及轉錄活化因子1在GBM細胞增殖、遷移和侵襲中發揮重要作用，并通過Wnt/β-catenin信號通路參與EMT，故下調信號轉導及轉錄活化因子1可抑制EMT，從而減弱GBM細胞的侵襲性[21]。有研究表明，Wnt/β-catenin信號通路與磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號通路之間存在串擾及相互作用。PI3K拮抗劑可以與miR-125b抑制劑協同通過抑制Wnt/β-catenin信號通路增強替莫唑胺誘導的GBM的耐藥性[22]。由此可見，GBM的惡性進展往往伴隨著Wnt/β-catenin信號通路的激活。小分子Wnt調節劑已被用于刺激或抑制Wnt/β-catenin信號的轉導，如高遷移率族盒轉錄因子1[23]。然而，現有的許多針對Wnt/β-catenin信號通路化合物的研究仍基于體外細胞實驗，缺乏必要的動物實驗及臨床試驗證據。因此，未來研制阻斷該通路的抑制劑和特異性藥物可能是治療GBM的方向之一。

2.3促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路 MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，通常有3個信號通路：胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)/MAPK、p38 MAPK、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)。Yang等[24]研究表明，血管生成素樣蛋白2在膠質瘤組織中高表達，當敲除該基因后，腫瘤細胞內磷酸化ERK1/2水平顯著降低，ERK/MAPK信號通路的活性被阻斷，而使用U0126(ERK/MAPK抑制劑)后，基因敲減組腫瘤細胞增殖和侵襲能力明顯增強。而p38 MAPK通路的激活可以將細胞外刺激與細胞反應聯系起來，從而增強腫瘤的侵襲性。過表達TGF-β激活的長非編碼RNA-ATB可以提高TGF-β誘導的膠質瘤細胞中磷酸化p38蛋白的表達水平，而磷酸化ERK和JNK的蛋白表達量未見明顯差異，使用p38 MAPK特異性抑制劑SB203580可以逆轉長鏈非編碼RNA-ATB介導的膠質瘤細胞侵襲[25]。可見，長鏈非編碼RNA-ATB可通過p38 MAPK通路加速EMT進程，從而促進膠質瘤細胞的侵襲。有文獻表明，RND2基因是p38 MAPK通路的內源性阻遏因子，它可以降低p38磷酸化，從而抑制p38 MAPK信號通路，使得GBM細胞自噬和凋亡顯著減少[26]。此外，Zhou等[27]研究認為，JNK信號通路在誘導自噬細胞死亡中起著重要作用，活化JNK可以促進GBM細胞的EMT，誘導自噬細胞死亡，增強GBM細胞的增殖和侵襲能力。綜上所述，ERK/MAPK、p38 MAPK、JNK 3個信號通路均可通過EMT促進GBM的惡性進展，但三者之間是否存在協同作用尚不清楚，因此MAPK信號通路在GBM中的機制還需進一步研究。

2.4Notch信號通路 Notch信號通路通常由4個受體(Notch1～4)和5個配體(Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3、DLL4)構成。受體和配體通過相互作用，使整合素金屬蛋白酶和γ-分泌酶復合體對受體進行兩次蛋白水解，從而激活信號通路。激活后的Notch通路在誘導和調節EMT中起著關鍵作用[28]。Notch可通過轉錄調控Snail、Twist等EMT相關信號分子來激活EMT，從而抑制E-cadherin的表達，促進N-cadherin和波形蛋白的表達，以增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力[29]。通常Notch配體以自分泌的方式作用于其產生的細胞，TGF-β可以誘導Jagged1等Notch配體高表達，沉默Notch通路的成分可阻止TGF-β誘導EMT[30]。Sarkar等[31]研究表明，Jagged1的高表達與膠質瘤的不良預后有關，通過RNA干擾敲除Jagged1可以明顯抑制膠質瘤細胞的存活和生長。

Notch通路在膠質瘤中既可以作為癌基因發揮作用，也可以作為腫瘤抑制因子發揮作用。一方面，膠質瘤細胞亞群中Notch通路可以調節膠質瘤干細胞與瘤內不同位置細胞間的相互作用，增強其干細胞特性和侵襲能力，并通過激活致癌途徑(如PI3K/Akt)促進腫瘤的發展[32]，如Notch通過調節牛磺酸上調基因1等長鏈非編碼RNA增強膠質瘤細胞的遷移和侵襲能力[33]。另一方面，在不同亞型膠質瘤患者中發現了Notch失活突變和低表達Notch相關靶基因的個體。在敲除Notch基因的膠質瘤小鼠模型中，Notch的缺失加速了膠質瘤的形成與惡化，表明Notch在膠質瘤中具有腫瘤抑制作用[34]。然而也有研究表明，敲除Notch基因可以增強GBM細胞的侵襲能力[35]。此外，Notch信號通路還可以通過與其他信號通路互相作用對GBM的發生發展產生影響。在神經母細胞特異性轉錄因子1高表達的GBM干細胞中，Notch可與Wnt/β-catenin信號通路產生協同作用，以抑制細胞分化并刺激增殖，從而促進腫瘤的惡性進展[36]。由此可見，Notch所有受體和配體是否均可通過EMT程序促進GBM細胞的惡性進展尚不清楚，Notch通路在GBM中的多重作用仍需進一步探究。

2.5PI3K/Akt/糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)通路 PI3K/Akt/GSK-3β信號通路與多種生物學進展有關，包括細胞增殖、干細胞維持和腫瘤持續生長[37]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，它只有轉移到細胞質膜并磷酸化后才能被激活。而PI3K的活性是Akt轉移至細胞質膜過程中必不可少的。GSK-3β是Akt的靶標。Gürsel等[38]研究表明，GSK-3β的活性在膠質瘤干細胞的存活和凋亡調控中起重要作用。Akt的高水平磷酸化可以誘導GSK-3β發生磷酸化，從而導致其失活。隨著GSK-3β的失活，β-catenin逐漸移位并積聚于細胞核，進而誘發EMT，導致細胞增殖和侵襲能力增強[39]。

PI3K/Akt通路是調控膠質瘤發生發展的重要信號通路。真核翻譯延長因子1D在GBM中高表達，敲除該基因后，E-cadherin表達升高，而N-cadherin、Snail、β-catenin等一系列間質標志物表達顯著下降，同時PI3K、磷酸化PI3K、Akt和磷酸化Akt的表達也明顯降低[40]。由此可見，敲除真核翻譯延長因子1D抑制了EMT和PI3K/Akt通路，進而影響GBM細胞的增殖和侵襲能力。Zhong等[41]使用PI3K和Akt抑制劑阻斷PI3K/Akt信號通路后發現，促癌基因LIM和SH3蛋白1 (LIM and SH3 protein 1，LASP1)誘導的膠質瘤細胞侵襲性顯著降低，而本應在過表達LASP1膠質瘤細胞中表達上調的波形蛋白和表達下調的E-cadherin也因PI3K/Akt信號通路的阻斷出現了逆轉，表明LASP1可通過PI3K/Akt信號通路誘導EMT，以發揮促癌作用。轉錄因子Snail可通過抑制PI3K/Akt信號通路誘導EMT。在過表達LASP1的膠質瘤細胞中，Snail表達上調，當抑制PI3K/Akt通路后，Snail表達下調[41]。Gao等[42]的研究發現，易位相關膜蛋白2在GBM中高表達，沉默易位相關膜蛋白2既可以顯著抑制GBM細胞的增殖、遷移和侵襲，也可明顯減少EMT的發生。而PI3K激活劑可逆轉易位相關膜蛋白2沉默對GBM生物學行為及EMT的影響，證實PI3K/Akt信號通路可誘導GBM發生EMT。PI3K/Akt/GSK-3β信號通路極其復雜，目前的研究尚未完全闡明，未來可能是GBM發生發展機制的研究方向之一。

3 GBM中EMT相關信號通路與miRNA

miRNA是真核生物中一類具有調控功能的非編碼RNA，由20～25個核苷酸組成，miRNA 可通過自身表達水平的改變調控相關目的基因的表達，從而發揮癌基因或抑癌基因的作用。miRNA通過參與調控EMT影響GBM細胞的增殖、遷移和侵襲。miR-504是GBM的腫瘤抑制因子，過表達miR-504可以直接抑制其靶基因FZD7，以阻斷Wnt/β-catenin信號通路，使β-catenin和磷酸化GSK-3β明顯減少，降低β-catenin 的核積聚，從而抑制EMT，減弱GBM細胞的遷移和侵襲[43]。另有文獻認為，當Notch1過表達時，由miR-139-5p誘導的GBM的EMT及侵襲性行為均得到逆轉[44]。同樣作為腫瘤抑制因子的miR-451通過靶向CAB39抑制PI3K/Akt信號通路降低間充質標志物(如N-cadherin、Twist、Snail及波形蛋白)的表達，增加E-cadherin的表達，進而抑制GBM從上皮形態向間充質形態的轉變[45]。另外，miRNA也可起到誘導促進EMT的作用。Ma等[46]研究表明，miR-10b可以協同TGF-β/Smad信號通路，使GBM中E-cadherin表達受到明顯抑制，波形蛋白表達明顯增加，從而誘導GBM細胞增殖、遷移和EMT。綜上，miRNA發揮促癌和抑癌作用均離不開EMT及其相關信號通路和信號分子。miRNA可作為治療GBM的潛在靶點和新方向，但目前缺乏miRNA通過MAPK信號通路誘導GBM發生EMT的文獻報道。

4 小 結

EMT是近年的研究熱點之一，其在人體多種病理生理過程中起重要作用。TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、MAPK、Notch、PI3K/Akt/GSK-3β 5種信號通路通過一系列復雜信號分子調控GBM細胞的增殖、遷移和侵襲。不同信號通路之間也存在著相互作用和相互轉化，而這些過程往往離不開miRNA的參與。然而，目前關于EMT在GBM中的研究多停留于體外細胞實驗階段，缺乏可靠的動物實驗及臨床試驗的佐證。因此，未來還需進一步探究EMT在GBM中的作用機制，這不僅有助于闡明GBM的發病機制，還能為研制出針對GBM的安全有效的靶向藥物提供可靠的理論依據。