活血解毒中藥有效成分以MAPK家族為靶點干預動脈粥樣硬化的研究進展

張 艷，周慶兵，2，李丹丹，張 瑤，3，徐鳳芹，2

心腦血管疾病的發生率及致殘、致死人數逐漸升高，嚴重威脅著人民群眾的健康安全。其中動脈粥樣硬化是冠心病、腦梗死等眾多心腦血管疾病的病理基礎[1]，其病理過程涉及血脂浸潤、慢性炎性、內皮損傷、平滑肌增殖等[2-3]。隨著CANTOS研究的成功，動脈粥樣硬化抗炎治療地位更為突出[4]。在炎癥背景下，針對絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)炎癥信號的治療可以作為干預動脈粥樣硬化進展的潛在策略。MAPK信號通路主要包括3個分支，其中細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)參與調控細胞增殖和分化，Jun N-末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)和p38激酶同工酶介導炎癥、應激和細胞凋亡。同時MAPK信號通路級聯反應參與動脈粥樣硬化的多種機制。

中醫學認為動脈易損斑塊破裂引起血栓、炎癥反應等形成急性心血管事件的病理特點與毒邪驟發性、火熱性等特點相契合。基于此，以陳可冀院士為主的科研團隊提出了“瘀毒致變”學說，使活血解毒方藥廣泛應用于動脈粥樣硬化的防治中。根據《中國藥典》2015年版，活血解毒中藥丹參、虎杖、川芎、梔子等及其活性成分可用于治療動脈粥樣硬化。活血解毒中藥有效成分干預MAPK與動脈粥樣硬化的研究日益增多，基于此，本研究深入分析活血解毒中藥的有效成分，探討其靶向調節MAPK參與動脈粥樣硬化形成的作用機制。

1 脂質浸潤

高血脂作為動脈粥樣硬化的獨立危險因素，對斑塊的形成起著基礎性作用。近年來，植物源降脂藥越來越受關注，其中小檗堿(berberine)是目前報道最多的天然植物藥。與他汀抗羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降脂途徑不同，小檗堿通過激活ERK1/2，穩定低密度脂蛋白受體(LDL-R)mRNA的表達，導致血清低密度脂蛋白(LDL)降低，可作為降脂新途徑[5]。此外，薈萃分析也發現，小檗堿可以改善血脂異常病人的脂質狀態[6]。川芎嗪(ligustrazine)是從川芎根莖中提取的生物堿成分。Duan等[7]對RAW264.7巨噬細胞和載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠主動脈斑塊的研究發現，川芎嗪可明顯增加膽固醇外流，抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的吸收，從而改善巨噬細胞脂質積累；川芎嗪通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)和p38 MAPK信號下調清道夫受體，上調三磷酸腺苷(ATP)結合盒轉運體A1(ABCA1)，從而抑制巨噬細胞的脂質積累。體內和體外實驗結果一致，進一步證實了川芎嗪對脂質積累的抑制作用。梔子苷(geniposide)主要來源于中藥梔子，為環烯醚萜類成分。在體內，梔子苷可以抑制西方飲食ApoE-/-小鼠總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。在體外，梔子苷通過調節與p38 MAPK和Akt信號通路相關的細胞膜中多種脂質轉運[下調清道夫受體抗體(SR-A)及上調ABCA1或清道夫受體B1(SRB1) mRNA和蛋白水平]的表達平衡，發揮抗動脈粥樣硬化且抑制溶血磷脂酸(LPA)誘導泡沫細胞形成[8]。在體內，番紅花酸(crocetin)通過抗氧化、抑制炎癥反應和p38 MAPK信號通路等途徑對高膽固醇飲食致動脈粥樣硬化Wistar大鼠產生降脂作用[9]。此外，丹參酮ⅡA也顯示出降脂潛力[10]。

2 內皮損傷

在血脂異常、炎性因子等危險因素刺激下，LDL-C進入受損血管內皮被氧化修飾為ox-LDL，加速血管內皮的損傷，使得第一道防線被破壞。

2.1 內皮細胞促炎活動激活 川芎嗪可以抑制脂多糖(LPS)刺激的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中白細胞介素-8(IL-8)的表達，其機制可能是與阻斷ERK、p38和核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路有關[11]。丹參屬于活血化瘀中藥，其主要脂溶性成分丹參酮ⅡA、隱丹參酮(cryptotanshinone)參與了抗動脈粥樣硬化各個環節[12]。丹參酮ⅡA通過抑制MAPK通路，阻止晚期糖基化終產物和活性氧(ROS)的積累，從而抑制甲基乙二醛(MGO)誘導的上皮損傷[13]。白藜蘆醇(resveratrol)來源于中藥虎杖，是一種多酚類化合物。白藜蘆醇通過抑制內皮細胞ERK/內皮型一氧化氮合酶(eNOS)-Thr495改善低剪切應力誘導的氧化應激[14]。此外，白藜蘆醇通過促進sirtuin-1誘導的NF-κB和p38 MAPK抑制作用，保護人臍靜脈內皮細胞抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導的損傷[15]。宋蕊等[16]研究表明，白藜蘆醇通過抑制MAPK及NF-κB信號通路的激活，從而降低動脈粥樣硬化家兔血清炎性因子水平白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、TNF-α。此外，王不留行黃酮苷通過抑制ROS/p38 MAPK，抑制ox-LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞間質化、炎癥和細胞凋亡，實現體內外抗動脈粥樣硬化的作用[17-18]。黃芩苷、漢黃芩素(wogonin)均來源于中藥黃芩，為黃酮類化合物。在體內黃芩苷抑制NF-κB和p38 MAPK信號通路，通過抗炎、降脂、抗氧化抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化[19]。丹參酮ⅡA對ApoE-/-小鼠的干預研究表明，丹參酮主要通過調控競爭性內源RNA(ceRNA)網絡，參與Ras、Rap1、MAPK、環磷酸腺苷(cAMP)等炎癥信號通路的基因來干預動脈粥樣硬化[20]；可能通過調控TNF-α/p38MAPK/NF-κB/視黃醇結合蛋白4(RBP4)信號通路，發揮調脂及抗炎(TNF-α、RBP4)作用[10]。此外，其他一系列化合物也通過此機制對內皮損傷表現出抗炎作用[21-23]。

2.2 內皮細胞凋亡 內皮細胞在不同因素(如ox-LDL、炎性因子)刺激下發生凋亡。血管內皮細胞凋亡導致內皮完整性喪失，促進動脈粥樣硬化的發展[24]。

在體外，小檗堿通過阻斷JNK介導的信號通路，增加髓樣細胞白血病因子-1(MCL-1)表達和超氧化物歧化酶(SOD)活性，減輕炎性因子的刺激，保護人臍靜脈內皮細胞免受脂多糖誘導的凋亡[25]。此外，小檗堿可通過下調p38 MAPK和NF-κB信號通路，降低細胞炎性因子IL-6、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-17A(IL-17A)、TNF-α表達和心肌細胞凋亡[26]。丹皮酚(paeonol)是從牡丹皮等中藥中分離得到的活性化合物。丹皮酚通過激活低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)/p38 MAPK/NF-κB通路抑制ox-LDL誘導的內皮細胞凋亡[27]。

3 巨噬細胞

巨噬細胞在動脈粥樣硬化形成過程中起著承上啟下的作用，通過清道夫受體吞噬ox-LDL轉化為泡沫細胞，形成動脈粥樣硬化最早的脂質條紋，同時可分泌多種生長因子[血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖細胞生長因子(FGF)]和促炎因子[TNF-α、白細胞介素-1(IL-1)]。許多藥用植物通過影響巨噬細胞的行為來實現抗動脈粥樣硬化作用，如抑制泡沫細胞形成、抑制巨噬細胞炎癥、調節巨噬細胞極化等。

3.1 抑制巨噬細胞炎癥 隱丹參酮通過抑制NF-κB和MAPK信號通路，抑制RAW264.7巨噬細胞炎性細胞因子(TNF-α、IL-6)的分泌[28]。趨化因子配體-20(CCL-20)作為一種趨化因子，在動脈粥樣硬化過程中發揮重要作用。丹參酚酸A(salvianolic acid A)是從中藥丹參中提取的水溶性生物活性化合物，可通過抑制p38 MAPK減輕TNF-α誘導的巨噬細胞及ApoE-/-小鼠中動脈粥樣硬化斑塊趨化因子配體-20的產生，達到抗動脈粥樣硬化及降脂作用[29]。

3.2 抑制泡沫細胞形成 巨噬細胞源性泡沫細胞促進動脈粥樣硬化形成最早的脂質條紋，是動脈粥樣硬化最典型特征。一系列化合物通過抑制泡沫細胞形成及脂質吸收來抑制動脈粥樣硬化。穿心蓮內酯(andrographolide)屬于二萜內酯類活性成分，在體內，穿心蓮內酯通過抑制p38 MAPK、ERK1/2和NF-κB信號通路，從而抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞形成泡沫細胞[30]。姜黃素(curcumin)是來源于姜黃根莖中的一種多酚類化合物，也可見于郁金、莪術等活血解毒藥物。姜黃素通過抑制p38 MAPK磷酸化，從而抑制ox-LDL誘導的CD36表達和泡沫細胞的形成[31]。梔子苷具有抗溶血磷脂酸誘導巨噬細胞形成泡沫細胞的作用。另外，梔子苷能通過MAPK、p38 MAPK和NF-κB信號通路明顯抑制巨噬細胞泡沫形成、脂質轉運和促炎細胞因子表達[8，32]。此外，紅景天甙也有抑制泡沫細胞形成作用[33]。

3.3 巨噬細胞極化 巨噬細胞主要分為M1、M2巨噬細胞兩種亞型。M1巨噬細胞與Th1細胞交流，分泌基質金屬蛋白酶促進膠原分解，削弱纖維帽。相反的，M2巨噬細胞分泌抗炎因子抵消M1巨噬細胞的促炎作用，同時分泌促纖維生長因子，維持斑塊穩定[34]。

在體內，梔子苷通過FOS/MAPK信號通路，分別抑制M1型巨噬細胞和促進M2型巨噬細胞極化，從而抑制和穩定新西蘭兔動脈粥樣硬化斑塊的發展進程[35]。姜黃素也有抑制M1型巨噬細胞極化的作用[36]。

3.4 抑制巨噬細胞凋亡 Guo等[37]研究表明，在RAW264.7巨噬細胞中，白藜蘆醇通過減少ROS生成、LOX-1和下調p38 MAPK通路來抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞凋亡[37]。在體外，黃芩苷通過劑量依賴性增強p38和JNK磷酸化的表達促進乙酰低密度脂蛋白(acetylate low-densitylipoprotein，AcLDL)和脂多糖誘導的巨噬細胞凋亡[38-39]。

3.5 維持斑塊穩定 姜黃素有降脂、抗炎、穩定斑塊、抗氧化及抗巨噬細胞極化等藥理作用[33]。姜黃素通過抑制丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)或ox-LDL誘導的巨噬細胞中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/MAPKs和蛋白激酶C(PKC)信號通路的激活，減輕基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)和基質金屬蛋白酶誘導劑(EMMPRIN)表達，以維持斑塊穩定[40-41]。黃連素、水蛭提取物也有上述類似作用[42-43]。

4 血管平滑肌細胞(VSMC)

VSMC是血管中重要的細胞組成，在動脈粥樣硬化早期，VSMCs具有較強的活化增殖能力，對防止斑塊破裂具有重要的保護作用；然而，由于斑塊中脂質的大量積累以及多種促炎因子生成，使得VSMC被ox-LDL激活，導致VSMC由“收縮”表型轉化為“合成”表型，這可能是促進炎癥反應和斑塊壞死的核心[44]。MAPK家族3個核心成員ERK、p38 MAPK、JNK與細胞增殖、遷移及血管重構密切相關[45-46]。因此，靶向MAPK家族的植物源化合物是一種潛在的預防血管平滑肌細胞異常增殖和遷移的治療策略。

川芎嗪通過抑制ROS的過量產生和p38 MAPK/JNK/ERK的磷酸化，對高糖誘導的血管平滑肌細胞損傷具有保護作用[47]。此外，有研究表明，川芎嗪可通過抑制ERK和P38 MAPK信號通路的激活，逆轉血小板源生長因子(PDGF-BB)誘導的增殖表型，部分下調血小板源生長因子誘導的VSMC的增殖和遷移[48]。穿心蓮內酯以濃度依賴性的方式抑制血小板源生長因子誘導的VSMC增殖，同時降低ERK1/2和增殖細胞核抗原(PCNA)的表達[49]。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)具有抗炎、抗凋亡、抗氧化應激的作用[50]。Jiang等[51]研究認為以TNF-α誘導VSMC可大量產生ROS，抑制血紅素加氧酶-1產生，并通過提升ERK1/2蛋白磷酸化水平、激活MAPK信號通路而誘導VSMC增殖和遷移。梔子苷、丹參酮ⅡA均通過誘導血紅素加氧酶-1的表達、ERK/MAPK和Akt通路的激活以及ROS的產生來抑制TNF-α誘導的VSMC的遷移和增殖[51]。Li等[52]研究發現，丹參酮ⅡA通過抑制MAPK信號通路和下調c-FOS表達，抑制VSMC增殖和減少內膜增生。除此之外，其他一些活性成分，如丹皮酚[53]、白藜蘆醇[54]、漢黃芩素[55]等也通過靶向MAPK信號通路調控平滑肌細胞遷移與增殖。

5 血栓形成

在管腔局部狹窄等血流動力學發生變化的情況下，血小板活化，在管腔黏附、聚集形成附壁血栓。活化的血小板又進一步釋放細胞因子，促進VSMC的增殖，形成串聯，加重動脈粥樣硬化的發生發展。

Lu等[56]研究表明，穿心蓮內酯通過激活eNOS-NO/cGMP通路，抑制PI3K/Akt/p38 MAPK和PLCγ2-PKC級聯，具有較強的抗血小板聚集活性。

6 其他相關新機制

6.1 表觀遺傳學 表觀遺傳學包括DNA甲基化、乙酰化及RNA甲基化等內容。最近，有研究通過DNA甲基化微陣列檢測發現動脈粥樣硬化病人主動脈斑塊內存在異常甲基化基因，經京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析發現主要涉及MAPK通路[57]。Zhou等[58]研究表明，梔子川芎膠囊可調節動脈粥樣硬化家兔異常甲基化基因(PRKCE、CACNB2、PRKCA等)也涉及MAPK信號通路。此外，梔子苷通過調控MAPK信號通路涉及基因甲基化水平，降低巨噬細胞泡沫化[59]。丹參酮ⅡA對ApoE-/-小鼠的非編碼RNA(ncRNA)表達譜分析表明，主要參與MAPK等炎癥通路，通過調節炎癥反應來影響ncRNA的表達[20]。N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)是存在于多種RNA中的化學修飾方式。隨著基因檢測技術的發展，m6A研究主要集中在腫瘤領域。有研究發現m6A與動脈粥樣硬化密切相關[60-61]，但目前在此領域研究還比較欠缺。未來，中醫藥可以在此領域深入研究。

6.2 腸道菌群 腸道菌群參與機體代謝及免疫過程，心血管疾病與腸道菌群緊密聯系。目前已證實某些中藥可通過腸道菌群結構及其代謝產物(氧化三甲胺、膽汁酸)改善動脈粥樣硬化的發生發展[62]。羅曉雅[63]研究顯示，小續命湯可能通過抑制PI3K/AkT/NF-κB及MAPK/JNK信號通路，干預急性腦缺血再灌注大鼠的腸道菌群結構以發揮抗炎和抗凋亡等作用。

7 MAPK信號通路中的分子對接模擬

隨著網絡藥理學和分子對接等現代生物技術的發展，越利于發現中草藥中活性成分與動脈粥樣硬化相關通路間的聯系。將單一化合物與靶點通過IGEMDOCK V2.1軟件模擬，以強調其與p38 MAPK、JNK1、JNK2、JNK3、ERK1、ERK2和ERK5蛋白的結合親和力。從圖1可以看出，這些天然化合物均可與p38 MAPK、JNK1、JNK2、JNK3、ERK1、ERK2和ERK5蛋白對接。分析發現在所有的中藥中都有結合強度最低的典型氨基酸，如ASN194、ASN152、ILE70。推測使用中藥靶向調節p38 MAPK/JNK/ERK來促進心臟保護主要與這些氨基酸有關。從熱圖可見，與MAPK核心蛋白對接最緊密的活性成分為黃芩苷，相反川芎嗪最不緊密。

8 問題與展望

動脈粥樣硬化是發生在動脈血管壁慢性炎癥性疾病，MAPK家族在動脈粥樣硬化病理過程中發揮著重要作用。近年來，調控MAPK信號通路防治動脈粥樣硬化的細胞及動物實驗均取得明顯進展。本研究綜述了在體內外干預MAPK級聯與動脈粥樣硬化的活血解毒中藥活性成分。研究顯示不同的細胞外刺激可通過影響MAPK家族單一成員，引起不同的細胞反應。相反，同一刺激可通過MAPKs家族與動脈粥樣硬化機制間的橋梁，引起不同細胞反應。這與中藥干預動脈粥樣硬化多靶點、多功效的特點不謀而合。

然而，目前中醫藥通過MAPK信號通路干預動脈粥樣硬化的研究主要局限于基礎領域，在未來大規模應用前缺乏臨床研究領域的反證。藥物始終如同一把“雙刃劍”，對于中藥的安全性需要高度重視。研究應深入到通路及具體靶標。既往研究也發現干預炎癥信號通路的藥對具有活血解毒的功效[64]。活血解毒中藥有效成分可通過調控動脈粥樣硬化形成機制與MAPK家族的連接構成治療動脈粥樣硬化的潛在策略。相信隨著醫學技術的進步和研究技術的不斷更新，如蛋白質組學、代謝組學、網絡藥理學、分子對接等，將會進一步闡明中藥有效成分誘導MAPK信號通路改變的新機制，闡明其對提高中藥臨床療效的重要性。