假絲酵母菌ERG11 和ERG3 基因突變與氟康唑耐藥的研究

王彥 馬芬芬 梁偉 王琨 劉霞 楊伏猛 王西珍

醫療水平的提升在很大的上延長了部分嚴重疾病患者的生存年限,但也增加了真菌感染性疾病發生的幾率。既往有資料記載［1］,侵襲性真菌感染者的死亡率高達50%,雖然部分抗真菌藥物對真菌感染的進程能起到一定控制作用,但伴隨真菌對其產生耐藥性及標準化抗真菌治療未取得顯著療效,臨床治療難度相應增加,越來越多的人投身到真菌的耐藥機制研究中。本文主要研究熱帶假絲酵母菌、白色假絲酵母菌可能的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選取2019 年1 月～2020 年6 月入住本院治療的100 例真菌培養陽性者,ATCC 90029 白色假絲酵母菌、ATCC 750 熱帶假絲酵母菌、ATCC 6258克柔假絲酵母菌作為標準質控菌株。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 DNA提取試劑盒,PCR試劑盒,PCR 引物及擴增儀、離心機及成像系統等。

1.2.2 菌株鑒定和體外藥敏試驗 對菌株采用分離、純化處理,初步篩選菌株。針對采集的菌株純化以后進行接種,恒溫孵育48 h,提取呈白、綠、藍、紫及紅色的酵母樣菌落作試樣；獲取DNA 后擴增、測序初篩后的菌株,完整標準化的分子生物學鑒定。利用專業軟件校正測序峰圖與基因序列(ITS1 區、D 區)。檢測采集到的100 株假絲酵母菌菌株的MIC,并進行體外藥物敏感性試驗,每次均選標準株作為質控菌株,其MIC值處于M27～S4 設定的區間中,就判讀對應的試驗操作有效。本次試驗獲得耐氟康唑的熱帶假絲酵母菌5 株、白色假絲酵母菌9 株。

1.2.3 提取假絲酵母菌DNA 嚴格依照基因抽提試劑盒說明書進行操作,提取以上分離株的基因組DNA。

1.2.4 基因擴增 分別把基因文庫登錄號AY856352與M23673 作為已知序列設定2 對引物,分別設置白色假絲酵母菌ERG3 引物序列和熱帶假絲酵母菌引物序列。PCR 擴增反應的主要參數：第Ⅰ階段：95℃條件下持續預變性5 min；第Ⅱ階段：內變性95℃ 30 s、退火55℃ 30 s、延伸70℃ 1 min,共計進行38次循環；第Ⅲ階段：70℃終延伸9 min,低溫(4℃)保存。PCR反應體系體積50 μl,包括forward primer 2 μl,reverse primer 2 μl,PCR master mix 25 ml,蒸餾水20 ml,DNA模版2 μl。PCR 擴增產物,EB 染色,凝膠成像下攝像。

1.2.5 產物純化及測序分析 委托權威機構對PCR產物進行雙向測序。

1.3 觀察指標 比較分析PCR 產物和GenBank 數據庫外供的基因序列,進而探尋到基因突變點。

2 結果

2.1 菌株鑒定和藥敏試驗情況 ITS1 擴增后形成了片段規格類似的條帶,在500～620 bp范圍中。鑒定發現,分離到的100 株假絲酵母菌內,其中熱帶假絲酵母菌、白色假絲酵母菌占真菌總數的65%,分別有15 株和50 株。其中9 株白色假絲酵母菌株的氟康唑24 h MIC＞16 mg/L,確定其是耐藥菌株；5 株熱帶假絲酵母菌對氟康唑和伏立康唑雙重耐藥。

2.2 PCR 擴增情況 PCR 對臨床分離獲得的14 株假絲酵母菌進行擴增,都獲得了預期產物,規格和DNA Marker 相比較,部位吻合,未形成非特異性產物帶。

2.3 基因測序情況 基于Blast 比較熱帶假絲酵母菌和白色假絲酵母菌的測序結果,將起始密碼子ATG的A 計數設定成1,基于此探尋到突變基因。5 株熱帶假絲酵母菌ERG11 基因存有同義、錯義突變分別為5、4 個,錯義突變分別是Y132H、G487T、A530C、G533C；ERG3 基因依次有7 個和12 個；白色假絲酵母菌ERG11 和ERG3 基因各發現4 個同義突變,前者有3 個錯義突變,后者為0。分析 ERG11 基因序列以后,發現其在氟康唑敏感菌株僅是發生了單個突變,康唑劑量自身依賴敏感程度和耐藥菌株內ERG11 基因突變以多位點錯義突變同時出現為主。

3 討論

既往有文獻報道,痰液、陰道、大便和腹水內白假絲酵母菌的檢出率相對較高,占比依次為76.1%、68.2%、63.7%和 60.0%,但是在血液與尿液內所占比例并不高,分別為31.8%和47.3%,熱帶假絲酵母菌在尿液內的檢出比例達到了12.4%,但是在痰液道、大便血液內的占比均不到7.0%。有文獻資料記載,在1997～1998年之間熱帶念珠菌的檢出率是4.6%,1999 年升至5.3%,2001～2003 年時這一指標的檢出值已經上升至7.4%。假絲酵母菌是臨床上發生率較高的一種真菌感染性疾病,免疫力正常的群體內以皮膚黏膜感染維主要表現,而在人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者、腫瘤化療者等免疫力偏低群體中經常表現為深部真菌感染或全身性的播撒式感染,并且感染經常屢次發作久治不愈。多烯類、唑類、嗎啡類等均是當下臨床常用的抗真菌類藥物［2］。唑類藥物特別是氟康唑有生物利用度高、組織穿透力強、半衰期長及療效顯著等優勢,從20世紀80年代以來,成為了防治假絲酵母菌感染的一線藥物。但規模化使用抗真菌藥物加快了藥物耐藥進程。

假絲酵母菌產生耐藥性的原因十分復雜,其耐藥機制主要和基因突變及過度表達、細胞壁組分變性與生物被膜產生等存在相關性。但既往已有研究證實,單個靶酶基因突變就會導致白假絲酵母菌對氟康唑的敏感性降低［3］。ERG11 基因也被叫做ERG16 或者CYP51A1 基因,其編碼蛋白為氮唑類藥物作用的靶酶,即羊毛固醇14-去甲基化酶(14-DM),該類酶是一種細胞色素P-450 酶,由528 個氨基酸構成,參與真菌細胞膜麥角固醇的合成過程,在維持細胞膜結構與功能常態化方面發揮著重要作用。ERG11 基因突變可能會引起參與編碼的氨基酸改變,Erg11P 結構隨之變化,進而作用于酶和藥物的親和過程,形成耐藥。既往有研究發現,ERG11 編碼的14-去甲基化酶為合成麥角固醇生物過程中的一種必需中間合成酶,唑類抗真菌藥能夠和本酶活性位點上的血紅蛋白結合,對真菌麥角固醇生物合成階段的關鍵酶活性能形成一定抑制作用,降低麥角固醇的合成效率,對真菌質膜的完整性造成不同程度的損傷,進而發揮抑制真菌生長、繁殖過程的作用。在本課題研究中,發現5 株熱帶假絲酵母菌ERG11 基因存有同義、錯義突變分別為5、4 個,錯義突變分別是Y132H、G487T、A530C、G533C,并且意外的發現錯義突變和多點位多變同時出現,本文報道出的突變位點都是已經位點,沒有探查到新突變。喬祖莎等［3］研究、總結了43 株假絲酵母菌體外藥敏實驗情況,發現氟康唑耐藥率達55.8%,RT-PCR 研究后發現ERG11 基因mRNA 呈現出高表達特征,PCR 對ERG11 基因測序過程中發現5 個基因出現了錯義突變情況,其中Y132H 基因和本文報道結果相一致。

細胞色素P-450 羊毛甾醇-14α-去甲基化酶為唑類化合物的主要作用靶點,通過結合羊毛甾醇-14α-去甲基化酶活性位點上的血紅蛋白,對羊毛甾醇-14α-去甲基化酶催化合成麥角甾醇的過程形成一定抑制作用,進而對真菌細胞膜造成損傷,對真菌正常生長、繁殖過程形成抑制作用。氟康唑靶酶編碼基因ERG11 突變與高表達是形成耐藥性的主因,也是國內外領域中研究的熱點問題之一。當下,國內很多學者針對酵母菌對唑類藥物產生的耐藥機制進行了大量研究,普遍認為主要和如下幾點相關：①唑類藥物作用的靶酶部分編碼基因突變,誘導編碼的氨基酸發生變化,進而影響酶和藥物之間的親和程度,形成耐藥性；②靶酶基由于表達過度生成了大量的靶酶,造成細胞中血藥濃度不能像初始那樣對酶生物活性形成抑制作用,這也是引起耐藥問題的主要原因之一；③外排泵出現不同程度的改變：ABCT 與MF 均是常見的外排泵基因,分別屬于ACB 轉運蛋白家族、易化擴散載體超家族,如果它們過度表達,則會導致細胞中藥物積累量降低,形成耐藥性。

本實驗研究中采集的100 株致病假絲酵母菌中,熱帶假絲酵母菌、白色假絲酵母菌分別有15株和50株,占真菌總數的65%［4］。分析各自占比不難發現伴隨假絲酵母菌病流行病學的改變,和過往報道相比較,非白色假絲酵母菌致病率有提高趨勢。比較經雙向測序獲得結果和標準菌株,白色假絲酵母菌ERG3 基因上未見新的突變點,ERG11 基因上存有T485A 與C795T兩個同義突變點［5］；而在熱帶假絲酵母菌ERG11 基因內新發現了C639T 同義突變點,其沒有引起氨基酸發生變化,ERG11 基因上存有同義、錯義突變分別有5、4 個［6］。鑒于白色假絲酵母菌樣本量過少的實況,ERG11 基因也成為眾多醫學者研究的重點,未見新的錯義突變位點,和既往研究報道結果相一致［7,8］。近期有學者在研究中指出,藥物敏感株和耐藥株兩者的形成同義位點的突變情況也可能會存在一定差異,對基因的表達程度基本不會形成明顯影響,可以聯合進行mRAN 檢測,進而更好的探究突變位點與耐藥兩者的相關性。

綜上所述,假絲酵母菌ERG11、ERG3 均存在程度不一的突變,其可能參與假絲酵母菌耐藥性形成過程。在后續研究中,為進一步檢驗基因突變與氟康唑耐藥性形成之間的關系,還需借助定點突變法進行,由功能性表達方面著手,探明假絲酵母菌的耐藥機制,為臨床合理安全選用抗真菌藥物提供更可靠的依據。