扶正口服液通過內質網應激途徑改善癌癥惡病質肌肉萎縮的機制研究

王理槐，竇 嫻，陳 晟，彭慧婷，何 曉，李涵予，楊 曉，劉 華，孫銀輝*

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

流行病調查數據顯示，惡性腫瘤目前已是危害我國人民健康的最主要影響因素之一[1-2]。在惡性腫瘤進展過程中，癌癥惡病質（cancer cachexia, CC）成為惡性腫瘤中晚期的常見并發癥，發病率為60%～80%，死亡率則高達80%，已成為晚期癌癥患者的直接死因之一[3-4]。 現代醫學營養支持只能在一定程度上緩解CC，總體療效欠佳。目前，有研究認為內質網應激（endoplasmic reticulum stress, ERS）與CC 骨骼肌萎縮密切相關[5]。適度的ERS 時，內質網應激相關性降解（endoplasmic reticulum associated degradation, ERAD）通路被激活，有利于細胞恢復內環境穩態和維持存活，但持續或高強度的ERS 將激活內質網應激性凋亡（endoplasmic reticulum stress induced apoptosis, ERSIA）途徑導致細胞凋亡[6]。 越來越多的實驗證明，內質網相關降解蛋白1（Derlin-1）的表達與ERS 關系密切，是調控細胞ERSIA 的關鍵點[7-11]。CC 屬于中醫學“虛勞”范疇，久病導致氣血陰陽俱虛，以脾腎不足為主，本著“虛則補之、損則益之”的治則，CC 的治療當著重脾腎雙補、氣血同調[12-13]。 本課題組運用湖南中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑扶正口服液治療CC，療效滿意并對其機制進行了初步探索。 本研究以Derlin-1 介導的ERAD-ERSIA通路為研究切入點，通過體外培養小鼠成肌細胞（C2C12）并使用小鼠結腸癌細胞（CT26）代謝液制備C2C12萎縮模型，給予扶正口服液含藥血清干預，從細胞、分子水平，初步探究扶正口服液改善CC 的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及動物

C2C12（品系：C3H，批號：CL-0044）細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；CT26（品系：BALB/c；批號：CL-0071）細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；BALB/C 小鼠40 只購自長沙市天勤生物技術有限公司，雄性，許可證號SCXK（湘）1019-0014，體質量25～30 g，鼠齡8 周。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 總RNA 提取試劑盒（批號：R1200）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：PC0020）、30%制膠液（批號：A1010）均來自索萊寶生物技術有限公司；通用逆轉錄試劑盒（批號：11141ES60）、RT-PCR熒光定量試劑盒（批號：11201ES08）均來自翊圣生物科技有限公司；TEMED（批號：Amresc00761）來自卡邁舒（上海）生物科技公司；蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物（批號：P1045）來自碧云天生物技術研究所；SYVN1（批號：DF12235）、IRE1（批號：DF7709）、XBP1（批號：AF5110）、DDIT3（批號：DF6025）、p-JNK（批號：AF3318）均來自江蘇親科生物研究中心有限公司；Derlin-1（批號：Ab176732）來自艾博抗（上海）貿易有限公司；羊抗兔-HRP（批號：bs-0295G-HRP）來自北京博奧森生物技術有限公司；扶正口服液（批號：20210518）來自湖南中醫醫藥大學第一附屬醫院藥劑科。

1.2.2 主要儀器 電泳儀[安諾倫(北京)生物科技有限公司，型號：1645070]；電轉儀[安諾倫(北京)生物科技有限公司，型號：BE6085]；pH 計[梅特勒托利多科技（上海）有限公司，型號：LP115]；酶標儀（美國博騰儀器有限公司，型號：800TS）；全自動化學發光圖像分析系統（上海醫療器械，型號：5200）；臺式低速離心機（上海醫療器械，型號：80-2）；RT-PCR 儀（蘇州雅睿生物技術股份有限公司，型號：MA-6000）；核酸檢測儀（杭州遂真生物技術有限公司，型號：F-1100）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 按照細胞培養方法（84%DMEM培養基、15%胎牛血清及1%青-鏈霉素）進行培養傳代，并于37 ℃、5%CO2、95%濕度的細胞培養箱中培養C2C12 細胞、CT26 細胞，完全培養基成分配比為89%RPMI-1640 培養基+10%胎牛血清+1%PB 雙抗，將細胞置于細胞培養箱（37 ℃、5%CO2、95%濕度）中培養，隔1 天換液1 次。 細胞長滿培養瓶底約90%時，PBS 沖洗后胰酶消化進行細胞傳代，取對數生長期的細胞進行實驗研究。

1.3.2 肌細胞萎縮模型建立 利用CT26 誘導C2C12 細胞萎縮[1]，用源CT26 細胞的條件培養基處理C2C12 細胞，收集CT26 細胞的代謝液備用。 棄C2C12 細胞上清液，用PBS 清洗1 次，加入70%CT26 細胞濾后代謝液+30%C2C12 完全培養基，48 h后于倒置顯微鏡觀察并記錄細胞形態，可觀察到肌管細胞萎縮現象，提示模型制備成功。

1.3.3 細胞轉染 用于敲除Derlin-1 的靶序列（表1），針對Derlin-1 和陰性對照干擾RNA（siRNA）委托吉凱基因化學技術有限公司提供。 轉染前1 天，將C2C12細胞傳入24 孔板，5×104個/孔，加入完全培養基，50 μL/孔，待轉染時細胞融合達到30%～50%時進行慢病毒感染。稀釋病毒，稀釋濃度為1×108個/mL。病毒懸液加完全培養基進行稀釋，稀釋病毒懸液、完全培養基、感染A 液配制成完全液感染病毒，按照每孔20 μL加入24 孔板中，按同樣的方法同時進行陰性對照組的感染，感染24 h 后更換完全培養基，繼續培養48 h，收集細胞后行Western blot 和RT-PCR 檢測Derlin-1蛋白及其mRNA 表達。

1.3.4 制備含藥血清 將40 只BALB/C 小鼠，隨機分成空白血清組和含藥血清組，每組20 只。 含藥血清組以扶正口服液灌胃，60 kg 給藥量為30 mL/d，根據人和小鼠的等效計量比[小鼠作用用藥劑量=30×9.1×（30 mL/60 kg）]，小鼠給藥量為136.5 mL/（kg·d）；空白血清組以同等劑量生理鹽水灌胃。灌胃1 次/d，持續7 d，第7 天灌胃1 h 后，眼眶靜脈叢采血，采集的各組血液保存于4 ℃冰箱，24 h 內以4 ℃、3000 r/min、半徑8 cm 離心15 min，用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，無菌試管分裝并標記組別及日期，放置于-20 ℃冰箱內保存。

1.3.5 分組干預 將含有Derlin-1 慢病毒穩定感染的C2C12 傳代細胞和空載細胞以5×104個/cm2的密度接種在6 孔板，分為空載組（A 組）、沉默組（B組）、惡病質+空載體+對照血清組（C 組）、惡病質+空載體+含藥血清組（D 組）、惡病質+沉默+含藥血清組（E 組）。 24 h 后PBS 洗滌3 次后，A、B 組加入普通培養基，在C、D、E 組分加入含有CT26 細胞條件培養基，培養96 h 即可構建惡病質細胞萎縮模型。96 h 換液后在A、B、C 組加入8%空白血清培養基，D、E 組加入8%含藥血清培養基，每組3 個復孔，在加藥后36 h 收取細胞，用于指標測定。

1.4 指標檢測

1.4.1 RT-PCR 檢測mRNA 表達 用TRIzol 試劑提取組織或細胞中的RNA，用Bio-Rad 的ScriptcDNAsynthesis 試劑盒行逆轉錄制備cDNA。

mRNA 定量使用Qiagen 公司的QuantiTect SYBR Green PCR 試劑盒，循環條件為：95 ℃15 min 進行45 個循環，每個再進行94 ℃15 s、57.5 ℃20 s、72 ℃20 s。測定結果分析使用Phafl 方法，計算基因表達的相對拷貝數。 引物設計見表1。

表1 引物列表

1.4.2 Western blot 檢測蛋白相對表達 在RIPA裂解緩沖液中提取來自細胞的總蛋白，并使用Bradford方法進行定量。 通過SDS-PAGE 分離蛋白質樣品并轉移到PVDF 膜，并在4 ℃下與用1% BSA 封閉液稀釋相應的一抗，使PVDF 膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。稀釋倍數如下：GAPDH 1∶10 000 稀釋、Derlin-1 1∶2000 稀釋、p-JNK 1∶2000 稀釋、CHOP 1∶500 稀釋、XBP1 1∶1000 稀釋、SYVN1 1∶2000 稀釋，用封閉液稀釋HRP 標記二抗1∶5000 稀釋與過氧化物酶偶聯的二抗在37 ℃溫育2 h。使用ECL 試劑盒顯現PVDF 膜上的靶蛋白，曝光結果使用Image J軟件分析灰度值。

1.4.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞接種于6 孔板，待細胞長至70%融合后分別加入空載siRNA 和Derlin-1 siRNA 轉染細胞。 轉染后48 h，C、D、E 組加入70% CT26 細胞濾后代謝液+30% C2C12 完全培養基，5% CO2培養箱內37 ℃培養24 h 后，C 組加入對照血清，D、E 組加入含藥血清，24 h 后用不含EDTA 的胰酶消化收集細胞，PBS 離心洗滌2 次，用400 μL Binding Buffer 懸浮，加5 μL Annexin VFITC，混勻，加5 μL 碘化丙啶混勻，室溫避光10 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 統計學處理

采用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析，計量資料數據用“±s”表示。 若符合參數檢驗條件，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q 檢驗;若不符合參數檢驗條件，兩獨立樣本采用近似t 檢驗，兩兩比較用秩和檢驗法。 均以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C2C12 細胞中慢病毒轉染后Derlin-1 表達

與A 組比較，B 組熒光表達減弱（P＜0.05）（圖1A）；與A 組比較，B 組Derlin-1 蛋白及其mRNA表達亦降低（P＜0.05）（圖1B、1C）。

圖1 熒光顯微鏡下C2C12 細胞形態學變化、Derlin-1 蛋白及其mRNA 表達比較

2.2 各組Derlin-1 表達及C2C12 細胞凋亡比較

與A 組比較，B、C、D 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達下降（P＜0.05），E 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達升高（P＜0.05）；與B 組比較，C 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達下降（P＜0.05），D、E 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達升高（P＜0.05）；與C 組比較，D、E 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達升高（P＜0.05）；與D 組比較，E 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達升高（P＜0.05）。 詳見圖2。

圖2 C2C12 細胞各組中Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達比較

與A 組比較，B、C、D、E 組凋亡率明顯上升（P＜0.05）；與B 組比較，C、D、E 組凋亡率下降（P＜0.05）；與C 組比較，D、E 組凋亡率下降（P＜0.05）；與D 組比較，E 組凋亡率下降（P＜0.05）。 詳見圖3。

圖3 各組C2C12 細胞凋亡率比較

2.3 各組細胞中CHOP mRNA 及其蛋白、p-JNK 蛋白表達比較

與A 組比較，B、C、D、E 組CHOP mRNA 及其蛋白、p-JNK 蛋白表達升高（P＜0.05）；與B 組比較，C組CHOP mRNA 及其蛋白、p-JNK 蛋白表達升高（P＜0.05），D、E 組CHOP mRNA 及其蛋白、p-JNK 蛋白表達下降（P＜0.05）；與C 組比較，D、E 組CHOP mRNA 及其蛋白、p-JNK 蛋白表達下降（P＜0.05）；與D組比較，E 組p-JNK 蛋白表達下降（P＜0.05）。 詳見圖4。

圖4 各組C2C12 細胞中CHOP、p-JNK mRNA 及其蛋白表達比較

2.4 各組細胞中SYVN1、XBP1 mRNA 及其蛋白表達比較

與A 組比較，B 組XBP1、SYVN1 mRNA 及其蛋白表達下降（P＜0.05），C、D、E 組XBP1、SYVN1 mRNA及其蛋白表達升高（P＜0.05）；與B 組比較，C、D、E組XBP1、SYVN1 mRNA 及其蛋白表達升高（P＜0.05）；與C 組比較，D、E 組XBP1、SYVN1 mRNA 及其蛋白表達升高（P＜0.05）；與D 組比較，E 組XBP1、SYVN1 mRNA 及其蛋白表達升高（P＜0.05）。 詳見圖5。

圖5 各組c2c12 細胞中SYVN1、XBPB1 mRNA 及其蛋白表達比較

3 討論

CC 是一種破壞性、多因素且通常不可逆的綜合征，根據腫瘤類型的不同，它會影響50%～80%的癌癥患者，導致大量患者的體質量減輕，影響后續抗癌治療的依從性。 迄今為止，尚無有效的干預措施完全逆轉惡病質。 因此，探索CC 潛在的分子機制尋求有效的干預策略有重要意義[14]。 骨骼肌萎縮被認為是CC 發生發展的重要原因之一，因此，探索改善癌性肌肉萎縮的線粒體機制，尋求干預肌肉萎縮作用靶點的有效藥物得以引起研究者們的重視。目前的研究提示，中醫藥可通過促進線粒體生成和改善線粒體氧化磷酸化功能改善癌因性肌肉萎縮[15]。

《素問·至真要大論》中有“諸濕腫滿，皆屬于脾”，在癌癥后期，臟腑功能受損，水谷精微生成運化功能失常，對肌肉供養不足，痰、飲、濕、瘀等病理產物停聚，再作為病理因素作用于機體，形成惡性循環，正所謂“百病皆由脾胃衰而生”。夏孟蛟等[16]認為CC 的關鍵病機是“寒濕入營”，大病后期，脾腎陽氣均虛，陰寒內生，濕阻經絡，深入探究了陽氣在CC發生發展過程中的關鍵地位，強調化氣溫陽是治療的重要治則。張媛等[17]認為癌癥后期正虛邪實并存，不忘陰虛合并血瘀這一特殊證型，強調以養陰填精、活血化瘀為主的治法，破除陰虛與血瘀互為因果的惡性循環，改善患者生活質量。因此，中醫治療CC的關鍵在于固護正氣、健脾補腎、補氣養血。 在此指導下，本科室運用院內制劑扶正口服液在臨床上干預CC 獲得了一定療效，本次細胞實驗結果也表明，在CT26 細胞誘導的C2C12 肌細胞萎縮模型中，經扶正口服液的干預，能夠明顯減緩C2C12 細胞的萎縮。

近年來研究發現，Derlin-1 的表達異常與腫瘤等多種疾病相關，肺癌中的研究也提示Derlin-1 可在61.86%的非小細胞肺癌中表達，并與腫瘤的淋巴轉移及腫瘤的TNM 分期有關，Derlin-1 的高度表達與癌癥患者的預后呈負相關[18]。 DONG 等[19]注意到Derlin-1 在非小細胞肺癌中過表達，免疫沉淀證實Derlin-1 通過EGFR-ERK 介導的MMP-2 和MMP-9上調促進侵襲，進一步的分析提示Derlin-1 過表達誘導EGFR 磷酸化。目前，研究已表明內質網應激反應與Derlin-1 的確存在一定的聯系，又有研究發現，Derlin-1 在過表達后，UPR 激活的程度降低，Bip 表達降低，XBP1 拼接形式（XBP1s）減少和XBP1 非拼接形式（XBP1u）表達增加[20]。

本研究結果顯示，沉默C2C12 中Derlin-1 基因后，肌細胞萎縮明顯，且細胞中CHOP、p-JNK 表達升高，XBP1、SYVN1 表達降低，而采用扶正口服液含藥血清干預后，C2C12 細胞中CHOP、p-JNK 蛋白表達降低，XBP1、SYVN1 表達升高。 以上結果提示Derlin-1 可通過下調肌細胞中CHOP、p-JNK，上調XBP1、SYVN1 而減輕CT26 誘導的C2C12 肌細胞萎縮凋亡，這可能與Derlin-1 參與調控ERS 信號通路有關。 扶正口服液可能是通過上調ERAD 核心蛋白Derlin-1 的表達而發揮干預CC 的作用，為“固護正氣、健脾補腎、補氣養血”的扶正口服液治療CC的功效提供現代科學依據，為臨床上治療CC 提供新的思路。