雙黃連注射劑及參麥注射液類過敏反應(yīng)的劑量相關(guān)性研究

李瓔峪，文 雯，劉紅宇*，李世雄，趙 靖，李原華，劉文龍

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；3.中藥成藥性與制劑制備湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208）

有關(guān)中藥注射劑的不良反應(yīng)報道顯示，過敏樣癥狀發(fā)生頻率較高，且大多數(shù)的中藥不良反應(yīng)/事件尚不明確，這與中藥注射劑的多成分、多靶點、多途徑有一定的關(guān)系，且常用于致敏物質(zhì)的研究僅局限于單一成分。 中藥注射劑是中醫(yī)藥理論與現(xiàn)代工藝技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物[1-2]，在急重癥等的治療中發(fā)揮了重要作用。 近年來， 隨著中藥注射劑監(jiān)管力度的加大、質(zhì)量要求增高，安全性問題越來越受到重視。 中藥注射劑不良反應(yīng)/事件以類過敏反應(yīng)為主。類過敏反應(yīng)的臨床癥狀與過敏反應(yīng)相似，主要癥狀為皮膚黏膜紅腫、瘙癢、腹痛、惡心、頭暈、呼吸困難等，也可致休克或死亡。但這兩者的性質(zhì)及產(chǎn)生機(jī)制不同，類過敏反應(yīng)屬于非免疫反應(yīng)，首次用藥30 min 內(nèi)可通過刺激肥大細(xì)胞/嗜堿性粒細(xì)胞或補(bǔ)體系統(tǒng)而釋放大量組胺，產(chǎn)生過敏樣癥狀[3-8]。 質(zhì)量控制是中藥注射劑安全保障的有效方法之一，常用的藥物質(zhì)量控制方法有代謝組學(xué)、一測多評法、指紋圖譜法等。 在臨床的防治策略及技術(shù)上，隨著多學(xué)科交叉、臨床研究、非臨床安全性再評價等研究的深入，中藥注射劑的整體安全性逐漸提高[9-11]。但在類過敏的防治上還需進(jìn)一步的發(fā)展。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級雄性ICR 小鼠，128 只，體質(zhì)量25～30 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2019-0004，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，動物倫理編號：201910090002。 小鼠實驗期間自由飲水?dāng)z食， 溫度20～26 ℃，濕度40%～70%。

1.2 藥品與試劑

注射用雙黃連（凍干）（哈藥集團(tuán)中藥二廠，批號：1904002）；參麥注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號：1912094）；注射用生理鹽水（湖南科倫制藥有限公司，批號：D20060706）；Compound48/80（美國Sigma-Aldrich 公司，批號：088M4120V）；伊文思藍(lán)（evans blue,EB，上海麥克林生化科技有限公司，批號：C1069175）；丙酮（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號：XK13-011-00034）；小鼠組胺ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：DPM78G9DWG）。

1.3 實驗儀器

TU-1900 型紫外檢測器（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；ME204E/MS205DU 型分析天平[梅特勒托利多科技（中國）有限公司]；H1850R 型臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；Multiskan MK3 型多功能酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；5414R 型高速離心機(jī)（艾本德中國有限公司）。

2 方法

2.1 藥物劑量、濃度

陽性組藥物為2.5 mg·mL-1的Compound48/80試液。

注射用雙黃連（凍干）成人給藥劑量為60 mg·kg-1，按小鼠與人的體表面積換算公式[12]換算得小鼠的給藥劑量約為647 mg·kg-1， 即雙黃連中組的給藥劑量，雙黃連低、高組劑量分別為323、1293 mg·kg-1。各組均用生理鹽水配制成相同給藥體積（10.8 mL·kg-1）的濃度。

參麥注射液成人給藥劑量為20～100 mL·d-1，取最小（20 mL·d-1）和最大（100 mL·d-1）及其中間（60 mL·d-1）劑量，按小鼠與人的體表面積換算公式，參麥低、中、高組劑量分別為3.6、10. 8、18.0 mL·kg-1。

2.2 分組及給藥

2.2.1 雙黃連注射劑及參麥注射液劑量考察分組 64只雄性ICR 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分組為8 組，每組8 只：對照Ⅰ組，陽性Ⅰ組，雙黃連低、中、高組，參麥低、中、高組，以上組別均含0.4% EB。

2.2.2 雙黃連注射劑及參麥注射液類過敏反應(yīng)模型分組 64 只雄性ICR 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為4 組：對照Ⅱ組、陽性Ⅱ組、雙黃連高組、參麥高組，每組16 只。

2.2.3 給藥 用藥組小鼠一次性尾靜脈注射相應(yīng)劑量的藥物，其中雙黃連低、中、高組用生理鹽水配制成相同給藥體積的濃度（即10.8 mL·kg-1），類過敏模型各組除參麥組外藥物均用生理鹽水配制成相同給藥體積的濃度（即10 mL·kg-1）。

2.3 小鼠類過敏反應(yīng)模型評價及檢測

2.3.1 小鼠類過敏反應(yīng)行為學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn) 以小鼠全身類過敏反應(yīng)癥狀表現(xiàn)[13]和過敏反應(yīng)指導(dǎo)原則[14]為標(biāo)準(zhǔn)，觀察并記錄給藥后15 min 內(nèi)各組小鼠的行為學(xué)變化，根據(jù)類過敏反應(yīng)癥狀分級標(biāo)準(zhǔn)對各組的反應(yīng)進(jìn)行評分與分級。根據(jù)表現(xiàn)癥狀進(jìn)行評分及類過敏程度分級，0 分代表陰性，0～1 分代表弱陽性/疑似類過敏，1～2 分代表陽性，2～3 分代表強(qiáng)陽性，3 分以上代表極強(qiáng)陽性，分?jǐn)?shù)越高對應(yīng)類過敏反應(yīng)程度越高。

2.3.2 小鼠耳郭藍(lán)染評價標(biāo)準(zhǔn) 行為學(xué)觀察結(jié)束后，脫頸椎處死各組小鼠并剪下雙耳，計算每組小鼠耳郭藍(lán)染反應(yīng)率，耳郭藍(lán)染反應(yīng)率=出現(xiàn)耳郭藍(lán)染的動物數(shù)/組內(nèi)動物數(shù)×100%。耳郭藍(lán)染面積（S）評分[15]根據(jù)小鼠雙耳郭藍(lán)染面積所占比例，S=0 分值為0，類過敏反應(yīng)強(qiáng)度為陰性；0＜S≤1/8 為1 分，類過敏反應(yīng)強(qiáng)度為疑似類過敏；1/8＜S≤1/4 為2 分，類過敏反應(yīng)強(qiáng)度為弱陽性；1/4＜S≤1/2 為3 分，類過敏反應(yīng)強(qiáng)度為陽性；1/2＜S≤3/4 為4 分，類過敏反應(yīng)強(qiáng)度為強(qiáng)陽性；3/4＜S≤1 為5 分，類過敏反應(yīng)強(qiáng)度為極強(qiáng)陽性。

2.3.3 小鼠耳郭EB 滲出量 評分后將耳郭剪碎，加丙酮與生理鹽水（7∶3）混合液2 mL，至-20 ℃冰箱內(nèi)浸泡過夜[15]。

取EB 母液，用丙酮與生理鹽水（7∶3）混合液稀釋 成 濃 度 為0.016 0、0.008 0、0.003 2、0.001 6、0.000 8、0.000 4 mg·mL-1的溶液，將小鼠雙耳的丙酮與生理鹽水（7∶3）浸液以3000 r·min-1離心15 min（半徑3 cm），取上清液，均用紫外分光光度計于610 nm 波長處測吸光度（A），繪制EB 紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各組EB 滲出量。

2.3.4 ELISA 法檢測小鼠血漿中的組胺 類過敏反應(yīng)模型組小鼠分別于給藥后10、30 min 取血，3000 r·min-1離心15 min（半徑3 cm），取上清液待測。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行組胺的測定操作。先平衡試劑盒、稀釋洗滌液、配制標(biāo)準(zhǔn)品待測；將樣品加入標(biāo)準(zhǔn)品中加入孔板中，37 ℃孵育45 min，甩干、洗滌排干重復(fù)3 次；在每孔加酶結(jié)合物工作液，封板，37 ℃溫育30 min，棄液甩干，重復(fù)洗板5 次；加底物，封板，37 ℃避光孵育，終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測量各孔的光密度（OD 值）。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 26.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，服從正態(tài)分布者采用單因素方差分析檢驗，不服從正態(tài)分布則采用Kruskal-Wallis 檢驗，實驗結(jié)果以“±s”表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠類過敏反應(yīng)行為學(xué)比較

以全身致敏性反應(yīng)癥狀分級標(biāo)準(zhǔn)對各組小鼠計分評級。 給藥后，對照Ⅰ組除個別小鼠出現(xiàn)豎毛外，未出現(xiàn)其他明顯的異常反應(yīng)，反應(yīng)等級均為陰性。陽性Ⅰ組小鼠均以搔鼻、豎毛、自發(fā)性活動減少、不安寧、排糞、步態(tài)不穩(wěn)等反應(yīng)為主，其中有2 例呼吸困難、2 例步態(tài)不穩(wěn)、1 例抽搐反應(yīng)，有1 例為協(xié)同反應(yīng)。 雙黃連低組小鼠以豎毛、搔鼻、排糞等反應(yīng)為主，3例出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)等強(qiáng)陽性反應(yīng)，無死亡；雙黃連中組小鼠以不安寧、排糞、排尿反應(yīng)為主，其中2例出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)等強(qiáng)陽性反應(yīng)，無死亡；雙黃連高組多表現(xiàn)為豎毛、自發(fā)性活動減少且大部分有步態(tài)不穩(wěn)表現(xiàn)，無死亡。 參麥低組部分小鼠有豎毛現(xiàn)象，反應(yīng)呈陰性；參麥中組部分小鼠有不安寧、豎毛、搔鼻反應(yīng)，反應(yīng)級別為陰性；參麥高組小鼠以搔鼻、不安寧、豎毛反應(yīng)為主，1 例出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)，反應(yīng)呈弱陽性。

與對照Ⅰ組相比，陽性Ⅰ組和雙黃連低、中、高組及參麥高組行為學(xué)評分升高（P＜0.05）；與陽性Ⅰ組比較，參麥低、中組行為學(xué)評分降低（P＜0.05）。 詳見表1。

表1 各組小鼠行為學(xué)評分比較（n=8）

3.2 各組小鼠耳郭藍(lán)染比較

3.2.1 各組小鼠耳郭藍(lán)染評分比較 對照Ⅰ組無藍(lán)染。與對照組Ⅰ相比，陽性Ⅰ組與各藥物組的小鼠耳郭出現(xiàn)不同程度藍(lán)染，隨著藥物組劑量加大，小鼠雙耳藍(lán)染面積增大。 詳見圖1。

圖1 各組小鼠類過敏反應(yīng)耳郭藍(lán)染情況

與對照Ⅰ組相比，陽性Ⅰ組和雙黃連低、中、高組及參麥高組耳郭藍(lán)染評分升高（P＜0.05）；與陽性Ⅰ組相比，雙黃連高組耳郭藍(lán)染評分升高，參麥低、中組耳郭藍(lán)染評分降低（P＜0.05）。 詳見表2。

表2 各組小鼠過敏反應(yīng)小鼠耳郭藍(lán)染評分（n=8）

3.2.2 各組小鼠耳郭EB 滲出量比較 以EB 濃度為x 軸，測得的吸光度A 為y 軸，繪制EB 標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到公式y(tǒng)=66.67 6x+0.000 88，R2=0.999 11。 紫外法檢測各組小鼠雙耳浸液的吸光度，結(jié)合EB 標(biāo)準(zhǔn)曲線，算得EB 滲出量。

與對照Ⅰ組相比，陽性Ⅰ組和雙黃連低、中、高組及參麥中、高組的小鼠雙耳EB 滲出濃度升高（P＜0.05）；與陽性Ⅰ組比較，雙黃連高組EB 滲出濃度升高（P＜0.05）。 詳見表3。

表3 小鼠耳郭EB 滲出量比較（n=8）

3.3 各組小鼠組胺濃度比較

運用ELISA Calc 對組胺標(biāo)準(zhǔn)品OD 值進(jìn)行Logistic 四參數(shù)擬合，得方程：y=(2.117 28-0.05 225)/[1+(x/4.912 48)^0.052 25]+0.009 36，R2=0.999 81，說明線性關(guān)系好。

結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各組血漿樣品的組胺濃度。給藥后10 min，與對照Ⅱ組比較，陽性Ⅱ組、雙黃連高組血漿中組胺濃度升高（P＜0.05）。 與給藥10 min后陽性Ⅱ組比較，給藥30 min 后陽性Ⅱ組組胺濃度降低（P＜0.05）。 詳見圖2。

圖2 不同反應(yīng)時間組胺濃度的組間比較（n=8）

4 討論

本研究以雙黃連注射劑及參麥注射液為對象，采用更靈敏且實驗易于操作的小鼠類過敏反應(yīng)模型[5]，以探究中藥注射劑給藥劑量與類過敏反應(yīng)發(fā)生的關(guān)聯(lián)性，為建立中藥注射劑安全性評價提供參考。

雙黃連是臨床上常用的清熱類中藥，常見的臨床靜脈制劑為粉針劑[16-17]。王麗娜[18]關(guān)于雙黃連注射劑致過敏性休克研究結(jié)果顯示，66 例不良反應(yīng)中有58 例為首次給藥發(fā)生，陳蕾等[19]的雙黃連注射劑不良反應(yīng)調(diào)查結(jié)果表明，大多不良反應(yīng)發(fā)生在30 min內(nèi)。 本研究以雙黃連注射劑臨床劑量（雙黃連中組）為中心展開類過敏反應(yīng)實驗，實驗結(jié)果表明雙黃連注射劑劑量越大，致小鼠類過敏程度越高，這一結(jié)果與王麗娜[18]報道的超劑量用藥產(chǎn)生不良反應(yīng)相同，雙黃連注射劑組胺濃度升高的時間規(guī)律與陳蕾等[19]提到的不良反應(yīng)時間一致。

參麥注射液為治療心腦血管類疾病的常用中藥制劑[20]，臨床上使用頻率高，在黃濟(jì)興等[21]心血管類中藥注射劑的合理利用分析報道中，參麥注射液超劑量使用頻率占比高。劉雪瑩等[22]研究證明，參麥注射液能激活補(bǔ)體系統(tǒng)產(chǎn)生類過敏反應(yīng)。 這些研究皆說明臨床上參麥注射液所致的不良反應(yīng)/事件大多數(shù)為類過敏反應(yīng)。 本研究中，參麥注射液類過敏模型采用一次性尾靜脈注射的方式，給藥速度快，與劉青等[23]報道參麥注射液的不良反應(yīng)/事件與給藥速度一致。 參麥低、中、高組的行為學(xué)及耳郭藍(lán)染分值逐漸增大，類過敏反應(yīng)程度逐漸增高，說明超劑量使用參麥注射液可能會導(dǎo)致類過敏反應(yīng)發(fā)生。

綜上所述，雙黃連注射劑及參麥注射液實驗結(jié)果表明，隨給藥劑量增加，類過敏反應(yīng)等級升高，臨床上多因超量使用、滴速過快等不合理用藥導(dǎo)致不良反應(yīng)/事件。雙黃連注射劑及參麥注射液的類過敏反應(yīng)實驗對中藥注射劑不良反應(yīng)/事件提供了參考，也為臨床上中藥注射劑給藥劑量及滴速的選擇提供了參考和依據(jù)。