扶正口服液對誘導性癌癥惡病質裸鼠骨骼肌中ERAD/ERSIA 通路的影響

孫銀輝，何 曉，李涵宇，竇 嫻，陳 晟，彭慧婷，楊 曉，劉 華，李 菁，王理槐*

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

癌癥惡病質（cancer cachexia, CC）是一組常見于惡性腫瘤晚期消耗性癥狀的總稱，是腫瘤患者死亡的原因之一，但其發病機制及有效治療策略尚待探索。 內質網應激（endoplasmic reticulum stress,ERS）介導的內質網應激相關性降解（ER-associated degradation, ERAD）-內質網應激性凋亡（endoplasmic reticulum stress induced apoptosis, ERSIA）途徑是機體細胞內蛋白質穩態和質量控制的關鍵機制，ERAD-ERSIA 穩態失衡在CC 骨骼肌消耗過程中扮演重要角色[1]，多項研究[2-3]證實，上調ERAD 途徑蛋白表達抗凋亡對細胞具有保護作用。 然而如何通過ERAD 途徑影響CC 肌肉代謝的抗凋亡機制則缺乏研究。課題組基于“脾在體合肉，主四肢，腎在體合骨”的生理特性及明代李中梓“脾腎互贊”學說，提出了“健脾益腎法干預CC 骨骼肌消耗”的治療思路，并創湖南中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑扶正口服液（主要由茯苓、黨參、太子參、熟地黃、黃精、女貞子、淫羊藿等組成）。 前期[4-8]研究證實，扶正口服液可通過降低腫瘤微環境中炎癥因子的表達改善CC，但其機制有待深入研究。 基于此，本研究擬使用扶正口服液干預不同階段的CC 模型裸鼠， 觀察不同時間段腫瘤體積、裸鼠攝食量、體質量變化，檢測ERAD 通路調控蛋白X 盒結合蛋白1（X-box binding protein1, XBP1）、內質網跨膜蛋白激酶1（inositol requiring enzyme 1, IRE1）、內質網相關降解蛋白1（Derlin-1）、滑膜細胞凋亡抑制物1（synovial apoptosis inhibitor 1, SYVN1） 表達和ERSIA 信號通路CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白 （CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein, CHOP）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）蛋白表達情況，探討扶正口服液對CC 的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/c-nu 裸鼠36 只，雄性，購自湖南安生美藥物研究院有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004，鼠齡4～5 周。 分籠喂養，自由采食，溫度為（24±3） ℃，濕度為40%～60%。實驗全程完成于湖南中醫藥大學動物實驗中心。 研究經湖南中醫藥大學動物實驗倫理委員會審批（審批號：LL2020052601），對動物的各種處理均遵循中華人民共和國科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》的相關規定。

1.2 實驗藥品、試劑及器材

扶正口服液（湖南中醫藥大學第一附屬醫院，批號：20210518）；SYVN1、IRE1、XBP1、CHOP、p-JNK（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：DF12235、DF7709、AF5110、DF6025、AF3318）；Derlin-1[艾博抗（上海）貿易有限公司，批號：Ab176732]；羊抗兔-HRP（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-0295GHRP）；30%制膠液（索萊寶生物技術有限公司，批號：A1010）。 YLS-Q6 型裸鼠灌胃器（淮北正華生物儀器設備有限公司）；Leica Dm LB2 型顯微鏡（美嘉儀器股份有限公司）；HXT/C 型低溫解剖操作臺（上海優浦科學儀器有限公司）；H2050R-1 型低溫高速離心機（上海華巖設備有限公司）；ACS-3 型電子記價秤（上海臺衡儀器儀表有限公司）。

1.3 CC 模型建立[9-11]及分組干預

選取36 只6～7 周齡BALB/c-nu SPF 級裸鼠，依據前期研究基礎及相關文獻[9-10]造模，采用苦寒瀉下、饑飽失常、力竭運動三因素誘導法誘導14 d，建立脾虛證裸鼠模型，隨機取12 只分為A 組（正常裸鼠生理鹽水灌胃）、B 組（正常裸鼠扶正口服液灌胃）。 剩余24 只脾虛證裸鼠右前腋下接種CT26 結腸癌細胞，接種劑量0.1 mL/只，接種過程在1 h 完成。接種后同時采用苦寒瀉下、饑飽失常兩因素誘導法，繼續誘導14 d，致瘤后體質量顯著下降，裸鼠右側腋下捫及腫塊，精神萎靡，無明顯自主活動，同時出現攝食量下降、體質量下降、毛發干枯及活動減少等癥狀時，提示CC 模型已建立。成功建立脾虛證裸鼠CC 模型的24 只裸鼠隨機分成A、B、C、D 組，每組6 只。

A 組：生理鹽水40 mL/kg 灌胃，連續56 d；B組：按人-小鼠等效劑量換算，灌胃扶正口服液（40 mL/kg），連續56 d；C 組：生理鹽水（40 mL/kg）于CC 后灌胃14 d；D 組：CC 后扶正口服液（40 mL/kg）灌胃14 d；E 組：生理鹽水（40 mL/kg）于CC 后灌胃28 d；F 組：CC 后連續灌胃扶正口服液（40 mL/kg）28 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 體質量測定 分別在0、14、28、42、56 d 解剖取材前各稱重1 次， 精確到0.01 g， 稱重時間選在14:00～16:00，最后以頸椎脫臼法處死各組實驗裸鼠，剝離出整個瘤體，測量比對其最大直徑，腫瘤組織經10%中性甲醛固定，以備組織切片及免疫組化分析使用；肌腱無損失分離雙側后肢骨骼肌備用。1.4.2 攝食量觀察 裸鼠同籠喂養，提供同一飼料，每日14:00～16:00 記錄每組裸鼠攝食總量。攝食量=前一日飼料量-次日剩余飼料量，測第14、28、42、56天的攝食量。

1.4.3 腫瘤體積測定 頸椎脫臼法處死各組實驗裸鼠，剝離瘤體，開始用游標卡尺測定腫瘤的長、短徑，按以下公式計算腫瘤體積：腫瘤體積（V）=1/2×a×b2，其中a、b 分別代表腫瘤的長徑(mm)、短徑(mm)。

1.5 HE 染色觀察骨骼肌組織病理學變化

將裸鼠肌肉組織放于標記編號的包埋盒中，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烤片，再進行HE 染色，在100 倍、400 倍視野進行采集。 將切片置于顯微鏡下，選取每塊肌肉橫截面內300～400 條肌纖維進行測量，在每塊肌肉橫截面切片圖像上，隨機選擇一個不位于圖像邊緣的方格作為起點，有規律地間隔若干個方格，分別計數各選定方格內的肌纖維(通過調整方格大小，保證最終能采集到足夠的肌纖維總數)，在計數每個方格內的肌纖維數目時，方格上方及左側邊框上的肌纖維不作計數和測量。 采集到足夠數量的肌纖維，并采用Image-Pro Plus 6.0 醫學圖像分析軟件分析，計算每塊肌肉的肌纖維橫截面積。

1.6 RT-PCR 檢測ERAD/ERSIA 信號通路激活情況

各組裸鼠取材后提取RNA，經多功能酶標儀檢查濃度后，去除殘留基因組DNA，逆轉錄制備cDNA，設置逆轉錄程序，逆轉錄后得到cDNA，稀釋10 倍，-20 ℃保存備用。 以2-ΔΔCt法(Livak 法)進行定量分析，再用校準樣本的ΔCt 值歸一試驗樣本的ΔCt值，最后計算表達水平比率。 引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列

1.7 Western blot 檢測ERAD/ERSIA 信號通路激活情況

從冰箱中取出凍存的樣本，稱取適量的組織按照1∶9 的比例加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液，在4 ℃的條件下震蕩至組織塊全部破碎，置于冰上裂解20 min，4 ℃，12 000 r/min 離心20 min，離心半徑8 cm，吸取上清。采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度，根據測定結果對蛋白濃度進行調整，保證不同組別之間蛋白濃度一致，根據實際情況計算樣本最終上樣量，與適量loading buffer 混勻，95 ℃煮5 min，冰浴冷卻后于-80 ℃保存。 制備電泳膠，上樣，電泳，轉膜，免疫印跡顯色，將每個指標與內參GAPDH 進行灰度值比較，計算出每個指標的相對灰度值，使用Graphpad prism（6.01）軟件進行繪圖。

1.8 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0 統計軟件完成，計量資料用“±s”表示，正態分布計量資料用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行比較，偏態分布計量資料采用秩和檢驗。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組裸鼠一般情況比較

實驗過程中，A、B 組裸鼠一直保持體格大小正常，體質量波動小，膚色紅潤等健康體征，未見異常；C、E 組腫瘤體積隨時間增長而增大，體格逐漸消瘦，裸鼠活動性差，膚色蒼白，皮褶度變大，CC 體征逐漸加重；D 組與C 組相比略顯紅潤，稍活躍；F 組與E 組相比體征有略微的改善。圖1a 為裸鼠處死前的拍照。

2.2 各組裸鼠腫瘤體積比較

實驗末期剖取瘤體拍照，測量計算腫瘤長短徑估算體積并對比。與C 組比較，D 組腫瘤體積減小（P＜0.05），E 組腫瘤體積明顯增大（P＜0.05）；與E 組比較，F 組腫瘤體積減小（P＜0.05）。 詳見圖1b、圖1c。

圖1 各組裸鼠一般情況及腫瘤體積變化情況

2.3 各組裸鼠攝食量、體質量比較

與A、B 組比較，C、D 組攝食量均下降（P＜0.05）；與C 組比較，D 組攝食量增加，E、F 組攝食量下降（P＜0.05）；與D 組比較，E、F 組攝食量下降（P＜0.05）；與E 組比較，F 組攝食量增加（P＜0.05）。 與A、B 組比較，在第6 周C、D 組體質量下降（P＜0.05），在第8周E、F 組體質量下降（P＜0.05）；與C 組比較，第6周D 組體質量增加（P＜0.05）；與E 組比較，第8 周F組體質量增加（P＜0.05）。 詳見圖2。

圖2 各組裸鼠攝食量、體質量變化情況

2.4 各組裸鼠骨骼肌組織病理變化

A、B 組骨骼肌組織肌纖維排列規則整齊，可見線粒體分布于相鄰的肌原纖維之間，C、D、E、F 組骨骼肌組織肌纖維腫脹，結構紊亂，排列不齊，肌橫紋不清晰，局部肌膜不完整，肌核分布不均，出現核聚集或部分肌細胞核消失，肌間隙嚴重消失；D、F 組較C、E 組肌纖維排列整齊，條理較清晰，只有少部分肌纖維腫脹，肌細胞核較均勻分布在肌膜下，無增生和腫脹或固縮，肌纖維間隙尚正常，且F 組較D 組改善更明顯。 詳見圖3。

圖3 各組裸鼠骨骼肌組織HE 染色

2.5 各組裸鼠骨骼肌組織中CHOP mRNA 及CHOP、p-JNK 蛋白表達比較

與A 組比較，B、C、D、E、F 組CHOP mRNA 及CHOP 蛋白表達下降（P＜0.05），C、D、E 組p-JNK 蛋白表達升高（P＜0.05），B、F 組p-JNK 蛋白表達下降（P＜0.05）。與B 組比較，C 組CHOP mRNA 及CHOP、p-JNK 蛋白表達升高（P＜0.05），D、E、F 組CHOP mRNA 表達下降（P＜0.05），D、E 組CHOP、p-JNK 蛋白表達升高（P＜0.05），F 組CHOP、p-JNK 蛋白表達下降（P＜0.05）。 與C 組比較，D、E、F 組CHOP mRNA及蛋白表達下降（P＜0.05），D、F 組p-JNK 蛋白表達下降（P＜0.05），E 組p-JNK 蛋白表達升高（P＜0.05）。與D 組比較，F 組CHOP mRNA 表達下降（P＜0.05），E組CHOP、p-JNK 蛋白表達升高（P＜0.05），F 組CHOP、p-JNK 蛋白表達下降（P＜0.05）。 與E 組比較，F 組CHOP mRNA 及CHOP、p-JNK 蛋白表達下降（P＜0.05）。 詳見圖4。

圖4 各組裸鼠骨骼肌組織CHOP mRNA 及CHOP、p-JNK 蛋白相對表達量比較

2.6 各組裸鼠骨骼肌組織中XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 及蛋白表達比較

與A 組比較，B 組XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1蛋白及mRNA 表達升高（P＜0.05）；C 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達下降（P＜0.05），IRE1 mRNA表達升高（P＜0.05），XBP1、IRE1、SYVN1 蛋白表 達 升高（P＜0.05），Derlin-1 蛋 白 表 達 下 降（P＜0.05）；D組XBP1 mRNA 表達下降（P＜0.05），Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達升高（P＜0.05），XBP1、Derlin-1、SYVN1蛋白表達升高（P＜0.05），IRE1 蛋白表達下降（P＜0.05）；E 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達下降（P＜0.05），IRE1 mRNA 表達升高（P＜0.05），XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 蛋白表達下降（P＜0.05）；F 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達下降（P＜0.05），IRE1 mRNA 表達升高（P＜0.05），XBP1、Derlin-1 蛋白表達下降（P＜0.05），IRE1、SYVN1 蛋白表達升高（P＜0.05）。 與B組比較，C 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 蛋白及mRNA表達下降（P＜0.05），IRE1 mRNA 及蛋白表達升高（P＜0.05）；D 組XBP1、DREL1、SYVN1、IRE1 mRNA表達下降（P＜0.05），XBP1、Derlin-1、SYVN1 蛋白表達升高（P＜0.05），IRE1 蛋白表達下降（P＜0.05）；E組XBP1、Derlin-1、SYVN1、mRNA 表達下降（P＜0.05），IRE1 mRNA 表達升高（P＜0.05）,XBP1、Derlin-1、SYVN1、IRE1 蛋白表達下降（P＜0.05）；F 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達下降（P＜0.05），IRE1 mRNA表達升高（P＜0.05）,XBP1、SYVN1 蛋白表達升高（P＜0.05），IRE1、Derlin-1 蛋白表達下降（P＜0.05）。 與C組比較，D 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 及蛋白表達升高（P＜0.05），IRE1 mRNA 及蛋白表達下降（P ＜0.05）；E 組XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 及蛋白表達下降（P＜0.05）；F 組IRE1 mRNA 表達下降（P＜0.05），XBP1、SYVN1 蛋白表達升高（P＜0.05），IRE1、Derlin-1 蛋白表達下降（P＜0.05）。 與D 組比較，E 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 表 達 下 降（P＜0.05），IRE1 mRNA 表達升高（P＜0.05），XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN 蛋白表達下降（P＜0.05）；F 組IRE1 mRNA 表達升高（P＜0.05），Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達下降（P＜0.05），XBP1、Derlin-1、SYVN 蛋白表達下降（P＜0.05），IRE1 蛋白表達升高（P＜0.05）。與E 組比，F 組XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 蛋白及mRNA 表達均升高（P＜0.05）。 詳見圖5。

圖5 各組裸鼠骨骼肌組織中XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN11mRNA 及蛋白相對表達量比較

3 討論

CC 狀態下，骨骼肌細胞內質網應激介導的未折疊蛋白反應通過減少錯誤折疊蛋白的生成緩解內質網壓力，不能被重新折疊的錯誤折疊蛋白通過ERAD 途徑予以降解以促進骨骼肌細胞生存。 若持續的ERAD 都不能恢復肌細胞內質網正常功能，則細胞啟動ERSIA 促進細胞死亡。 因此，“ERADERSIA 穩態失衡”在CC 骨骼肌消耗過程中扮演重要角色[11]，促進恢復“ERAD-ERSIA 穩態”是治療CC的潛在策略。

研究表明，內質網應激、線粒體通路、死亡受體通路及氧化應激等均參與了細胞凋亡，其中ERS 是目前的研究熱點[12]。研究發現，ERS 包括未折疊蛋白反應、內質網相關性死亡和整合應激反應是3 個相互聯系的動態過程，其中最主要的是未折疊蛋白反應[13]。研究證實，ERS 表達過強或者持續時間過長均會引發細胞凋亡，ERS 是引發細胞凋亡的重要途徑[14]。ERS 主要通過CHOP、JNK、Caspase-12 途徑誘導凋亡，其中CHOP 介導的細胞凋亡信號通路是ERSIA的主要形式[15]。 同時，ERAD 的大致過程為羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶降解蛋白1(hydroxymethylglutaryl-goA reductase degradation protein 1, Hrd1)通過一種目前尚未知的機制識別并結合錯誤折疊蛋白，接著由Derlin-1、硒蛋白（VCP/P97-interacting membrane protein, VIMP)、E3 泛素連接酶和p97 組成的復合物也加入其中，最終形成一個更大的轉位復合物。錯誤折疊蛋白經泛素化修飾后，通過跨膜通道轉運至細胞質蛋白酶體中降解，XBP1、IRE1、SYVN1也被證實在ERAD 途徑中有重要作用[16]。

本研究顯示，隨著腫瘤的增長，C、D、E、F 組裸鼠的體質量逐漸下降，第6 周發現，在扶正口服液的作用下D 組裸鼠體質量較C 組有升高的趨勢，第8周發現，在扶正口服液的作用下F 組裸鼠體質量較E 組有升高的趨勢，緩解了CC。同時，D、F 組裸鼠的攝食量較未給藥的裸鼠有所提升。CC 病程中腫瘤體積會逐漸增大，但D、F 組較同期C、E 組腫瘤體積減小，提示扶正口服液可能通過減小腫瘤體積緩解CC。 通過RT-PCR、Western blot 法檢測組織蛋白、mRNA 的表達發現：ERSIA 主要通路蛋白CHOP、p-JNK 在D 組較C 組表達下降，在F 組較E 組表達下降；ERAD 途徑的主要通路蛋白XBP-1、Derlin-1、SYVN1 則 在D 組 較C 組 表 達 升 高，XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 蛋白在F 組較E 組表達升高。上述結果提示在CC 過程中，扶正口服液可能通過抑制ERSIA 的促骨骼肌凋亡途徑和促進ERAD 的骨骼肌細胞抗凋亡途徑，糾正“ERAD-ERSIA 失衡”而改善CC 狀態。

同時，本研究團隊發現扶正口服液干預晚期CC 優于早期CC。中醫認為，腫瘤初期，正氣未虛，瘀毒邪氣內盛，此時當以驅邪為主[17-19]。 若此時重用健脾益腎法為主的扶正口服液，則閉門留寇，邪毒更甚，故早期使用扶正口服液干預CC 無明顯療效優勢；腫瘤晚期時，機體邪正俱虛，但正虛更甚，難以驅邪外出[20-22]。 此時使用扶正口服液以扶正祛邪，用藥切合病機，故晚期扶正口服液干預CC 的療效明顯。

綜上所述，本研究證實扶正口服液的抗CC 作用及其優勢作用時間，初步揭示了ERAD-ERSIA 通路在CC 中的作用。 扶正口服液通過上調骨骼肌XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 蛋白表達激活ERAD通路，下調CHOP、p-JNK 蛋白表達抑制ERSIA 通路，糾正“ERAD-ERSIA 穩態失衡”是其抗CC 的機制之一。 這為扶正口服液臨床用于改善腫瘤晚期CC提供了支撐，后續將繼續對該制劑的藥理機制做深入探索。