玉郎傘多糖對S180 荷瘤小鼠氧化應激、免疫調節及血管生成的影響

覃 妮，陸世銀，羅文婷，陳家豪，龍嘉怡，黃仁彬*

[1.柳州市中醫醫院（柳州市壯醫醫院）藥學部，廣西 柳州 545026；2.廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021]

玉朗傘（Yulangsan, YLS）為蝶形花科植物疏葉崖豆[Millettia pulchra Kurz var－laxior (Dunn) Z. Wei]的塊根。 玉郎傘多糖(Yulangsan polysaccharides,YLSPS)是從塊根中提取的多糖組分，具有祛瘀止痛、消癰排膿、清熱解毒等功效[1-2]。 現代藥理研究表明，YLSPS 具有提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性[3-4]，其抗腫瘤潛力已得到證實[5-6]。 然而，YLSPS 對腫瘤血管生成的影響及作用機制的相關研究報道較少。腫瘤血管形成是腫瘤增殖、侵襲和遷移的基礎，結合YLSPS 具有抗氧化、免疫調節功能的前期研究結果[7-8]，本研究通過建立小鼠S180移植瘤模型，從腫瘤免疫、氧化應激和血管生成的角度探討YLSPS 的抑瘤作用機制，為其抗腫瘤機制研究提供新的科學依據。

1 材料

1.1 主要儀器

ACB-4A1 型超凈工作臺（新加坡ESCO 公司）；XS205DU 型電子分析天平（瑞士梅托勒公司）；MULTISKAN MK3 型酶聯免疫檢測儀、CKX-41 型倒置熒光顯微鏡（德國奧林巴斯公司）；Micro CL17R型高速低溫離心機（美國賽默飛世爾科技公司）；TDL-5A 型臺式離心機（上海菲恰爾分析儀器公司）；TU-1800 型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器公司）；4590 型包埋機（日本SAKURA精密技術公司）；RM223 型5 病理組織切片機（德國徠卡公司）；SIM-F140AY65-PC 型顆粒制冰機（日本松下電器）；HH-8 型電熱恒溫水浴鍋（上海汗諾儀器公司）；CD-UPH-II-20L 型超純水器（成都越純科技公司）。

1.2 實驗動物

SPF 級雌雄各半昆明小鼠，體質量（20±2） g，購自廣西醫科大學實驗動物中心。 動物許可證號：SCXK（桂）2020-0002。

1.3 細胞株

小鼠肉瘤S180細胞株由廣西醫科大學病理生理學教研室提供，并定期進行腹腔接種傳代保株。

1.4 藥物與試劑

藥品YLSPS（批號：YLS20210312619），由廣西醫科大學藥理教研室提供；注射用環磷酰胺（批號：5J078A），購自德國Baxter Oncology GmbH。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD，批號：20210401）、谷胱甘肽過氧化物（glutathione peroxidase, GSHPX，批號：20210328）活性，丙二醛（malondialdehyde,MDA，批號：20210401）及過氧化氫酶（catalase, CAT，批號：20210330）的含量、考馬斯亮蘭（批號：20210219）檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所產品；VEGF ELISA 試劑盒（批號：ab222510）購自欣博盛公司；Anti-CD34 antibody（批號：ab81289），購自美國Abcam 公司。

2 方法

2.1 YLSPS 的制備[9]

將干燥YLS 粉碎后，加8 倍量的純水煎煮，趁熱過濾取濾液，離心取上清液，加入95%乙醇適量與所得上清液混合，使乙醇終濃度為80%，再用無水乙醇、丙酮萃取洗滌5 次，Sevage 法去除蛋白，上清液經透析后濃縮，加5 倍無水乙醇，水溶解后再醇析，重復3 次，直至280、260 nm 波長處無雜蛋白和核酸吸收峰為止，過濾，收集沉淀物，真空干燥得多糖干粉（含生藥量26.64 g·g-1）。

2.2 S180 移植瘤模型的建立與給藥

將S180細胞在無菌條件下接種于健康小鼠腹腔，待腹水生長旺盛時，抽出乳白色腹水，用生理鹽水按1∶10 稀釋后以臺盼藍拒染法檢測存活率＞90%，細胞計數，調整細胞濃度至1×107·mL-1。 取60只小鼠，每只于右側腋窩皮下接種0.2 mL 細胞懸液，隔日觀察瘤體生長情況，當皮下移植瘤長至直徑約5 mm時為造模成功。 將造模成功的小鼠隨機分為5組（n=10）：模型組每天灌胃等體積的生理鹽水；CTX組為陽性對照腹腔注射環磷酰胺（cyclophosphamide,CTX）20 mg·kg-1·d-1；YLSPS 低、中、高劑量組灌胃給藥依次為150、300、600 mg·kg-1·d-1。 連續給藥8 d。

2.3 YLSPS 對S180 荷瘤小鼠體質量、臟器指數及腫瘤生長的影響

觀察每組小鼠給藥后的體質量、活動情況、精神狀態、皮毛色澤等。 末次給藥24 h 后，稱量小鼠體質量，摘眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，解剖取出S180 肉瘤、胸腺、脾臟，用濾紙吸干殘血后，分別精確稱量并記錄，并分別計算抑瘤率與臟器指數（脾臟、胸腺）。 抑瘤率＝（腫瘤模型組的平均瘤重－給藥組的平均瘤重）／腫瘤模型組的平均瘤重×100%。 臟器指數＝臟器重量（mg）／體質量（g）。

2.4 YLSPS 對S180 荷瘤小鼠血清生化指標水平的影響

將取得的小鼠血液，室溫靜置后離心（離心半徑10 cm，3500 r/min，15 min）取上清液并按試劑盒說明書操作，對血清中SOD、GSH-PX、CAT、MDA 和VEGF 含量進行檢測。

2.5 HE 染色觀察YLSPS 對S180 荷瘤小鼠的病理學的改變

取適量腫瘤組織置于10%甲醛固定24 h，經組織脫水、透明，石蠟包埋制片，3 μm 連續切片以二甲苯脫蠟，梯度乙醇浸泡水化后，浸泡于水中，然后進行HE 染色。在光學顯微鏡下觀察、比較腫瘤細胞的形態變化。

2.6 免疫組化法檢測YLSPS 對S180 荷瘤小鼠瘤組織內微血管密度的影響

腫瘤組織切片經脫蠟、抗原修復后，按免疫組化試劑盒說明書分別滴加CD34 鼠抗單克隆抗體和二抗，DAB 顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、鏡下觀察。 CD34 陽性血管內皮細胞被染成棕色或棕黃色，相互分離的內皮細胞且無顯著管腔或由內皮細胞形成管腔，當管腔小于8個紅細胞面積者即為微血管，先低倍光鏡下（100×）選擇微血管密集的腫瘤區域，然后通過高倍鏡下（400×）隨機計數3 個視野內所有染色的微血管數，平均值作為微血管密度（microvessel density, MVD）。

2.7 數據統計與分析

采用SPSS 20.0 軟件進行數據統計學分析，所有資料均作正態性檢驗和方差齊性檢驗，實驗數據以“±s”表示，用單因素方差分析結果。 多組間比較采用方差分析，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 YLSPS 對S180 荷瘤小鼠生長狀態與腫瘤抑制的影響

各組小鼠接種S180細胞后1 周腫瘤直徑約為5 mm，小鼠精神萎靡，行動遲緩，毛發干枯蓬松，腫瘤生長迅速，各給藥組有不同程度的緩解。如表1 所示，CTX 組抑瘤率為73.83%，YLSPS 低、中、高劑量組的抑瘤率分別為34.75%、47.46%和58.78%。 與模型組比較，各給藥組均可顯著抑制腫瘤生長（P＜0.001）。此外，CTX 組荷瘤小鼠胸腺指數、脾臟指數明顯下降，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.001）。YLSPS 各劑量組荷瘤小鼠胸腺指數、脾臟指數與模型組比較均具有增高的趨勢，且高、中劑量組尤為顯著（P＜0.05，P＜0.001）。 詳見表1。

表1 YLSPS 對S180 荷瘤小鼠體質量及腫瘤抑制、脾臟指數、胸腺指數的影響（±s，n=10）

表1 YLSPS 對S180 荷瘤小鼠體質量及腫瘤抑制、脾臟指數、胸腺指數的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，***P＜0.001。

組別模型組CTX 組YLSPS 低劑量YLSPS 中劑量YLSPS 高劑量體質量/g 27.78±0.78 27.09±1.11 26.28±1.03 26.77±0.89 28.52±0.93胸腺指數/（mg·g-1）2.92±0.32 0.97±0.25***2.99±0.55 3.21±0.78*3.63±0.45***脾臟指數/（mg·g-1）4.78±0.56 2.95±0.49***4.87±0.74 5.11±0.55*5.70±0.37***瘤重/g 1.51±0.45 0.39±0.09***0.98±0.16***0.79±0.22***0.67±0.16***抑瘤率/%—73.83 34.75 47.46 58.78

3.2 YLSPS 對S180 荷瘤小鼠血清生化指標水平的影響

與模型組比較，YLSPS 各劑量組小鼠血清SOD活性顯著升高（P＜0.05，P＜0.001），YLSPS 低劑量組有提高GSH-Px、CAT 活性的趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），而中、高劑量組GSH-Px、CAT 活性明顯增強，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.001）。相較于模型組，YLSPS 中、高劑量組中MDA 含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.001）。與模型組比較，CTX 組小鼠血清SOD 活性升高（P＜0.05），而GSH-Px、CAT 活性呈現明顯下調趨勢，MDA 水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.001）。 詳見表2。

表2 YLSPS 對S180 荷瘤小鼠血清GSH-Px、CAT、SOD、MDA 水平的影響（±s，n=10）

表2 YLSPS 對S180 荷瘤小鼠血清GSH-Px、CAT、SOD、MDA 水平的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05,***P＜0.001。

組別模型組CTX 組YLSPS 低劑量YLSPS 中劑量YLSPS 高劑量MDA/（nmol·mL-1）5.64±0.49 6.78±0.52***5.49±0.79 5.26±0.63*4.92±0.63***SOD/（U·mL-1）198.17±9.56 208.55±7.79*208.25±9.64*211.12±9.28***213.35±8.60***GSH-Px/（U·mL-1）721.01±11.24 633.85±12.26***734.88±13.03 746.97±21.78*791.54±16.01***CAT/（U·mg-1）369.69±22.81 341.28±14.08*378.34±16.61 424.77±16.46***517.39±13.15***

3.3 YLSPS 對S180 荷瘤小鼠腫瘤組織病理學的影響

模型組中腫瘤細胞豐富且紊亂分布，細胞結構、形態完整且大小不一，瘤細胞異型性明顯，呈現病理性核分裂現象。 經藥物干預后，各給藥組腫瘤細胞及細胞染色質皺縮，異型性降低，病理性核分裂減少，可見散在的與融合成片狀的壞死灶。詳見圖1A。

3.4 YLSPS 對S180 荷瘤小鼠移植瘤MVD 的影響

模型組腫瘤組織內CD34 陽性染色的微血管數量眾多，而經藥物干預后，CTX 組、YLSPS 不同劑量組腫瘤組織內CD34 陽性染色的微血管數量較模型組均顯著減少（P＜0.001），提示YLSPS 可減少實體瘤組織MVD，且YLSPS 對MVD抑制作用強度呈劑量依賴性，高劑量組與CTX 組作用相當。 如表3所示，與模型組相比，CTX 組對VEGF 表達具有顯著抑制作用（P＜0.001），而YLSPS 低劑量組有下調VEGF 表達的趨勢，但差異化未達到顯著水平，差異無統計學意義（P＞0.05），YLSPS中、高劑量組對VEGF 表達有明顯的抑制作用，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.001）。 詳見表3 和圖1B。

圖1 YLSPS 對S180 荷瘤小鼠腫瘤組織病理學與微血管數量的影響

表3 YLSPS 對S180 荷瘤小鼠VEGF 表達和MVD 的影響（±s，n=10）

表3 YLSPS 對S180 荷瘤小鼠VEGF 表達和MVD 的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05,***P＜0.001。

組別模型組CTX 組YLSPS 低劑量YLSPS 中劑量YLSPS 高劑量MVD/（CD34）43.02±7.19 16.82±3.52***37.10±6.23***21.14±5.81***19.98±5.21***VEGF/(pg·mL-1)21.02±1.13 8.82±0.51***20.10±0.93 18.14±0.85*16.98±0.98***

4 討論

在復雜的循環與代謝中，多糖承擔著能量儲存與來源或結構材料的角色，參與細胞的轉化和凋亡、免疫功能調節、抗氧化、細胞間物質運輸與信號傳導等生物過程，發揮重要的生理功能作用[10]。當多糖類與免疫細胞的表面多糖受體結合時，可激活細胞的信號轉導途徑，促使巨噬細胞產生細胞因子，進而誘導和調控免疫反應、抑制腫瘤或癌細胞的生長增殖[11-12]。 YLSPS 可通過抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移、誘導腫瘤細胞凋亡等途徑發揮抗腫瘤作用[5]。本研究利用小鼠S180移植瘤模型探討YLSPS對荷瘤小鼠的抑瘤作用，證實了YLSPS 具有較好的抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長的作用，展現了較好的應用前景。

機體免疫功能的下降會加劇腫瘤的發生和發展，而腫瘤的出現也往往導致機體免疫器官的萎縮和免疫能力的衰弱[13]。其中，胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，其指數可在一定程度上衡量機體的免疫水平[14]。本實驗結果顯示，經YLSPS 干預后S180荷瘤小鼠脾臟指數和胸腺指數均具有不同程度地回升，呈現劑量依賴性，表明YLSPS 具有改善荷瘤小鼠脾臟和胸腺損傷的作用，提示YLSPS 可能通過提升機體免疫功能發揮抗腫瘤作用。

氧化應激與腫瘤的發生發展密切相關，當機體微環境處于氧化應激狀態時，體內自由基代謝紊亂，基因轉錄、細胞信號轉導、酶和生物大分子活性及細胞的增殖、分化、凋亡等生理功能異常，最終導致腫瘤[15]。 植物多糖具有直接清除活性氧和提高抗氧化酶活性的作用，從而發揮抗氧化功效[16]。SOD 作為一種過氧化物分解酶，是機體關鍵的抗氧化防御物質，體內自由基清除速率隨著SOD 活性的升高而加快。GSH-Px 是體內常見的重要催化氧化酶之一，通過其還原過氧化物的作用，從而阻斷了脂質過氧化的鏈式反應。 當機體發生氧化應激時，部分脂肪酸會氧化分解為一系列復雜的化合物，其中就包括MDA，此時體內的MDA 水平顯示了脂質過氧化水平。 正常生理狀況下機體擁有由GSH-Px、CAT、SOD等抗氧化物酶構成的一套完整的抗氧化防御體系，它們在體內保持動態平衡[17]，而當抗氧化防御體系失衡出現異常時，致使MDA 等脂質過氧化產物大量生成并累積，隨后造成細胞的氧化損傷，最終導致腫瘤的發生與發展[18]。本研究表明，YLSPS 治療后能明顯上調S180荷瘤小鼠血清中GSH-Px、CAT 和SOD 水平，下調MDA 水平。說明YLSPS 可通過提高S180荷瘤小鼠抗氧化酶活性、抑制脂質過氧化反應和清除自由基等方式抑制荷瘤小鼠機體內氧化應激，進而抑制腫瘤生長。提示YLSPS 能通過抑制氧化應激發揮其抗腫瘤作用。

前期研究發現，YLSPS 可抗血管生成[5]，故推測YLSPS 可能通過抑制血管生成發揮抗腫瘤作用。MVD 是當前公認評價腫瘤血管生成程度的重要指標，可通過檢測MVD 探討藥物對腫瘤血管生成的調控作用[19]。 本實驗以免疫組化法測定小鼠腫瘤組織血管內皮細胞CD34 的陽性水平，計算微血管密度，結果表明YLSPS 各劑量組均能顯著降低實體瘤組織的MVD，從而抑制S180荷瘤血管的生成。 此外，VEGF 為至今公認作用最強、專屬性最好的促血管內皮細胞增殖和促血管生成因子，其表達水平高低可衡量血管形成能力的大小，在實體瘤血管新生過程中具有舉足輕重的作用[20]。研究證實，體內腫瘤由于微環境的變化與癌基因的激活表達促使腫瘤細胞大量生成VEGF[21]。VEGF 對腫瘤血管內皮細胞上的VEGF 受體具有高度選擇性，從而介導內皮細胞增殖、分裂、遷移；其次可提高微小血管的通透性，致使血漿大分子外滲沉積在血管外的基質中，加速了腫瘤細胞的生長和新生血管網的形成，同時也為腫瘤細胞的遠處侵襲提供通道[22]。 新生血管促進腫瘤持續發展，而腫瘤發展又誘導VEGF 快速大量累積，使腫瘤發展形成一種惡性循環。因此，針對VEGF 及其受體的靶向干預手段可改善腫瘤內新生血管生成，有助于抑制腫瘤的生長、侵襲和擴散。 本研究通過ELISA 法檢測了S180荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF 蛋白的表達，結果表明YLSPS 中、高劑量可顯著抑制VEGF 蛋白的表達。

綜上所述，YLSPS 具有調節小鼠免疫功能、抑制氧化應激及抗S180荷瘤小鼠腫瘤生長的作用，并能降低腫瘤組織中VEGF 的表達及MVD，提示YLSPS抗腫瘤機制與改善免疫功能、抗氧化及抑制腫瘤血管的生成有關。