Graves病患者促甲狀腺素受體抗體與腸道菌群及短鏈脂肪酸的相關(guān)性

王 華 史婷婷 信 中華 琳 李 聰 曹秋梅*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院南區(qū)急診科,北京 102600；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 102600；3.首都醫(yī)科大學(xué)生物工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)信息學(xué)系，北京 100069)

腸道菌群是指在人體胃腸道內(nèi)定植的有機(jī)微生物群，被稱作人體“第二大腦”，對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[1-2]。短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)是腸道菌群發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生的一類重要的信號(hào)分子，是含有1～6個(gè)碳原子的有機(jī)脂肪酸的總稱，主要包含乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等[3]。研究[4-5]證實(shí)SCFAs參與腸上皮細(xì)胞的能量供應(yīng)，維持腸黏膜屏障通透性以及具有抗炎和抗腫瘤等作用，在腸道疾病和免疫性疾病中扮演重要角色。近年來有研究[6]表明，腸道菌群的改變?cè)诩谞钕偌膊∪鐦虮静　raves病及甲狀腺癌中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，研究[7]表明，初診Graves病患者的腸道菌群及代謝產(chǎn)物SCFAs發(fā)生顯著性變化，但是Graves病的患者如果經(jīng)過藥物治療后甲狀腺激素水平恢復(fù)正常時(shí)，腸道菌群及代謝產(chǎn)物的水平是否與正常人存在差異？促甲狀腺素受體抗體(thyrotropin receptor auto-antibodies，TRAb)在Graves病的進(jìn)展及預(yù)后中發(fā)揮重要的作用，該抗體的血清滴度是否與腸道菌群及代謝產(chǎn)物具有相關(guān)性？關(guān)于此部分的研究較少。本研究入組了藥物治療后甲狀腺功能正常的Graves病患者及健康對(duì)照者，通過16S rRNA測(cè)序了解兩組人群的糞便腸道菌群結(jié)構(gòu)，氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)測(cè)定兩組的SCFAs濃度，分析血清TRAb滴度與差異菌群及代謝物的相關(guān)性，為Graves病的治療提供新思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

將2018年3月至2019年12月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院急診科及內(nèi)分泌科被診斷為Graves病的患者中選取30例治療后甲狀腺功能正常的患者作為病例組(Graves組)。Graves病患者入組標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)合臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)檢查，已確診為Graves病,應(yīng)用甲巰咪唑片(德國默克公司，國藥準(zhǔn)字J20171078，規(guī)格10 mg/片)治療半年后甲狀腺功能正常的患者。②年齡≥18歲。③神志清楚，配合隨訪。Graves組排除標(biāo)準(zhǔn)：①甲狀腺功能異常者；②既往對(duì)抗甲狀腺藥物過敏，有放射性碘或甲狀腺手術(shù)治療史；③1個(gè)月前抗生素、微生物制劑、免疫抑制劑或激素類藥物使用史；④合并其他自身免疫性疾病；⑤妊娠期或哺乳期婦女；⑥合并其他嚴(yán)重原發(fā)性疾病，包括糖尿病、高血壓、高血脂等；合并惡性腫瘤；胃腸道手術(shù)史，素食主義，以及乙醇或其他藥物依賴史，伴有精神障礙及認(rèn)知障礙者[8]。

同期選取32名健康志愿者為對(duì)照組。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①性別、年齡匹配；②血、尿常規(guī)、生化檢查及甲狀腺功能均無明顯異常。③甲狀腺超聲無異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往被確診的糖尿病患者、急慢性感染性疾病、有嚴(yán)重肝腎疾病史及自身免疫疾病病史的人群；②有1個(gè)月前抗生素、微生物制劑、免疫抑制劑或激素類藥物使用史者；③懷孕或哺乳期婦女；④素食主義，以及乙醇或其他藥物依賴史，伴有精神障礙及認(rèn)知障礙者。

1.2 資料收集

內(nèi)容包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、吸煙史、肝腎功能、甲狀腺功能檢查、甲狀腺自身抗體及患者用藥史。研究方案符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：20160501)。病例組及對(duì)照組受試者均簽署書面知情同意書。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.3.1 血清甲狀腺激素測(cè)定

血清甲狀腺激素[游離三碘甲腺原氨酸(free triiodothyronine, FT3)、 游離甲狀腺素(free thyroxine, FT4)、三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine, T3)、四碘甲腺原氨酸(thyroxine, T4))和促甲狀腺激素 (thyroid-stimulating homone, TSH)]在 ADVIA Centaur XP Immunoassay系統(tǒng)平臺(tái)中進(jìn)行檢測(cè)(德國西門子公司)。TRAb滴度的測(cè)定采用電化學(xué)發(fā)光法(德國Roche公司)。參考范圍(FT3:3.50～6.50 pmol/L，F(xiàn)T4:11.50～22.70 pmol/L，TSH:0.55～4.78 μIU/mL，TRAb:0.00～1.75 IU/L)。

1.3.2 糞便標(biāo)本的收集

Graves組患者在治療6個(gè)月時(shí)甲狀腺功能恢復(fù)正常后留取糞便標(biāo)本，對(duì)照組同期留取糞便標(biāo)本。標(biāo)本均是空腹8 h晨起留取。每個(gè)受試者收集不少于2.5 g的新鮮糞便樣本，裝于含有DNA 穩(wěn)定劑的糞便采集管中(PSP Spin Stool DNA Plus Kit, Stratec Molecular公司, 德國)。糞便樣本均儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中。

1.3.3 糞便16S rRNA測(cè)序及生物信息學(xué)分析

使用Stool DNA Kit進(jìn)行糞便DNA提取，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量，對(duì)糞便細(xì)菌16S rDNA的V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選用引物515F (5′-GTG CCA GCMGCC GCG GTAA-3′) 和 806R (5′-GGA CTACHVGGG TWT CTAAT-3′) 進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)過Illumina Hiseq 2000測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序(諾禾致源公司)。去除原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量的Reads，通過97%相似度的標(biāo)準(zhǔn)聚類，得到操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)。分別從每個(gè)聚類單元挑選1條代表性序列，以Greengene 13.8的數(shù)據(jù)庫為模板注釋物種名稱組成OTUs。基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU聚類及物種分析。繪制韋恩圖(Venn diagram)分析兩組之間特有或共有的OTU,直觀地表現(xiàn)樣本在OTU水平上的組成相似性及重疊情況。

根據(jù)物種豐度表進(jìn)行Alpha(α)多樣性分析、Beta(β)多樣性分析及物種分類與豐度分析。α多樣性其水平能反映個(gè)體腸道菌群的豐富性和多樣性。其中， Chao1及Ace指數(shù)A用于評(píng)價(jià)菌群豐富度，simpson與shannon指數(shù)用于評(píng)價(jià)菌群多樣性和均勻性，Goods_coverage指數(shù)評(píng)估測(cè)序深度。采用 BIPES QIIME分析流程進(jìn)行提取和處理測(cè)序數(shù)據(jù)，采用linear discriminant analysis(LDA)coupled with effect size measurements(LEfSe)在線工具尋找組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌群。

1.3.4 GC-MS法測(cè)定SCFA

檢測(cè)指標(biāo)包括：乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸、己酸。空腹8 h晨起取血，離心取血清150 μL，加入100 μL磷酸，再加75 μg/mL的內(nèi)標(biāo)(異己酸)溶液20 μL和乙醚280 μL勻漿1 min，于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清上機(jī)待測(cè)。檢測(cè)平臺(tái)：Thermo TRACE 1310-ISQLT氣-質(zhì)聯(lián)用儀(Thermo公司，美國)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組基本臨床特征比較

Graves組患者及對(duì)照組的年齡、性別、BMI、尿素氮、肌酐及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組的門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但數(shù)值均在正常范圍。雖然組間T3、T4及TSH濃度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是兩組的FT3、FT4、T3、T4及TSH濃度均在正常范圍，差異沒有臨床意義。Graves組的TRAb濃度明顯升高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，詳見表1。

表1 Graves組與對(duì)照組的一般臨床特征比較Tab.1 Baseline characteristics of patients with Graves and controls

2.2 Alpha(α)多樣性分析

統(tǒng)計(jì)分析顯示，Alpha多樣性指標(biāo)在兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 Graves組與對(duì)照組腸道菌群的Alpha多樣性指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of Alpha diversity in intestinal microbia between GD patients and controls

2.3 OTUs分析的韋恩圖分析

如圖1所示，Graves組特有OTU 940個(gè)，對(duì)照組特有OTU 196個(gè)，兩組重疊OTU 1 480個(gè)，Graves組OTU豐度較對(duì)照組增加。

圖1 Graves組及對(duì)照組腸道菌群OTUs分析的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of OTUs analysis of intestinal flora in GD patients and control

2.4 Graves組及對(duì)照組腸道菌群綱水平(Class)差異性分析

在綱水平，與對(duì)照組相比，只有柔膜菌綱(Erysipelotrichia)在Graves組豐度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

2.5 Graves組及對(duì)照組腸道菌群科水平(Family)差異性分析

在科水平，與對(duì)照組相比，Graves組的擬桿菌科(Bacteroidaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae) 及理研菌科(Rikenellaceae)豐度下降，普雷沃菌科(Prevotellaceae)、韋榮球菌科(Erysipelotrichaceae)及消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)豐度升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

2.6 Graves組及對(duì)照組腸道菌群種水平(Species)差異性分析

在種水平，與對(duì)照組相比，Graves組的Bacterium_LF-3、瘤胃球菌屬(Ruminococcus-bromii) 、霍氏真桿菌(Eubacterium_hallii)、瘤胃球菌(Ruminococcus—SP-Marseille-P328)、反芻動(dòng)物真桿菌(Eubacterium_ventriosum)、多爾菌(Dorea_longicatena及Dorea_formicigenerans)豐度升高。而瘤胃球菌(Ruminococcus-bicirculans)、普通擬桿菌(Bacteroide_vulgatus)、華德薩特菌(Sutterella_wadsworthensis)、顫桿菌(Oscilibacter_sp_ER4)及另枝菌(Alistipes_shahii)豐度下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

2.7 Graves及對(duì)照組糞便中特異性差異腸道菌群

Graves組和對(duì)照組間的LEfSe統(tǒng)計(jì)的差異菌屬如圖5A所示，不同顏色分別代表在兩組內(nèi)各自富集的菌屬：在Graves組普雷沃菌(f_Prevotellaceae及g_unidentified_Prevotellaceae)及厭氧菌(s_Prevotellacopri)富集，其中f_Prevotellaceae富集程度最高。在對(duì)照組中，擬桿菌(s_Bacteroides_plebeius), 罕見小球菌屬(g_Subdoligranulum) 及瘤胃球菌科(f_Ruminococcacea) 富集，其中f_Ruminococcaceae富集程度最高。

圖2 Graves組及對(duì)照組的綱水平差異菌相對(duì)豐度比較 Fig.2 Comparison of the bacterial abundance at the class level in patients with GD and controlsControl: n=32；GD: Graves disease, n=30.

圖3 Graves組及對(duì)照組的科水平差異菌相對(duì)豐度比較Fig.3 Comparison of the bacterial abundance at the Family level in patients with GD and controls Control: n=32；GD: Graves disease,n=30.

圖4 Graves組及對(duì)照組的種水平差異菌相對(duì)豐度比較Fig.4 Comparison of the bacterial abundance at the Species level in patients with GD and controlsControl: n=32；GD: Graves disease, n=30.

2.8 功能預(yù)測(cè)

基于SILVA數(shù)據(jù)庫的物種注釋，本研究通過Tax4Fun方法對(duì)兩組之間的菌群進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。與對(duì)照組相比，在Level 2水平，Graves組菌群的糖代謝、脂肪酸代謝及細(xì)胞合成和信號(hào)傳導(dǎo)等通路水平顯著下調(diào)，而轉(zhuǎn)錄通路、能量代謝及酶家族活性等通路水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6)。

2.9 短鏈脂肪酸測(cè)定

液相色譜法測(cè)定Graves組及對(duì)照組的短鏈脂肪酸濃度。與對(duì)照組相比，Graves組的丙酸及丁酸的濃度明顯降低，而異戊酸濃度明顯升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余短鏈脂肪酸濃度在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖7)。

圖5 Graves組及對(duì)照組差異菌群LEfSe分析Fig.5 LEfSe analysis between the intestinal microbiota in patients with GD and controls

圖6 Graves組及對(duì)照組差異代謝途徑Fig.6 Comparisons of changes in the predicted function abundance between GD and control Control: n=32；GD: Graves disease, n=30.

2.10 腸道菌群與短鏈脂肪酸的相關(guān)性分析

Graves組中腸道菌群及短鏈脂肪酸的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，丙酸與瘤胃球菌呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.376，P=0.041，圖8)。

2.11 TRAb抗體滴度與腸道菌群的相關(guān)性分析

TRAb抗體的滴度與差異腸道菌群相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TRAb滴度與胃瘤球菌豐度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.349，P=0.022，圖9)。

3 討論

腸道菌群與人體宿主保持動(dòng)態(tài)平衡，在保護(hù)腸道、抵御病原、代謝及免疫等方面發(fā)揮著重要的作用。腸道菌群紊亂與多種免疫性疾病密切相關(guān)，成為多種疾病治療的新靶點(diǎn)。近年來有研究[9]表明，腸道菌群在甲狀腺疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。腸道菌群中耶爾森菌、乳桿菌、直腸真桿菌、雙歧桿菌、分節(jié)絲狀菌、普雷沃菌屬等通過分子模擬等機(jī)制引起交叉免疫反應(yīng)從而誘發(fā)甲狀腺功能亢進(jìn)(以下簡稱甲亢)的發(fā)生。本研究團(tuán)隊(duì)既往研究[10]顯示，Graves病合并甲狀腺性眼病患者的腸道菌群發(fā)生了顯著改變。林凱等[11]報(bào)道，Graves病患者腸道耶爾森菌、分節(jié)絲狀菌、直腸真桿菌數(shù)量均高于健康組，而雙歧桿菌、乳桿菌、普雷沃菌屬數(shù)量均低于健康組。有研究[12]顯示，甲狀腺功能的異常本身會(huì)對(duì)腸道菌群的構(gòu)成產(chǎn)生影響。如果甲狀腺功能恢復(fù)正常，腸道菌群是否與對(duì)照組有差異？本研究納入了經(jīng)過治療甲狀腺功能恢復(fù)正常的Graves患者與對(duì)照組。本研究顯示，雖然Graves組患者的甲狀腺功能恢復(fù)正常，但是與對(duì)照組相比，Graves組患者的普雷沃菌(Prevotellaceae)等豐度升高，而擬桿菌(Bacteroidaceae)及瘤胃球菌(Ruminococcaceae) 等豐度下降， LEfSe分析顯示Graves組普雷沃菌(f_Prevotellaceaeg_unidentified_Prevotellaceae)富集，其中f_Prevotellaceae富集程度最高。普雷沃菌有可能是Graves病的一個(gè)特征性菌群，但腸道菌群的個(gè)體差異較大，多種因素如飲食、地域等都會(huì)影響個(gè)體的腸道菌群，這是部分研究結(jié)果不一致的原因之一，因此還需要宏基因組測(cè)序等進(jìn)一步的研究。本研究結(jié)果表明，即使甲狀腺功能恢復(fù)正常，Graves組患者的腸道菌群與對(duì)照組相比差異仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖7 GC-MS法測(cè)定Graves組及對(duì)照組SCFA濃度Fig.7 Assay of SCFA levels in GD group and control by GC-MS

圖8 丙酸濃度與瘤胃球菌豐度的關(guān)聯(lián)分析Fig.8 Correlation analysis of propionic acid and Ruminococcus

圖9 TRAb抗體滴度與瘤胃球菌豐度的關(guān)聯(lián)分析 Fig.9 Correlation Analysis of TRAb and Ruminococcus TRAb: thyrotropin receptor auto-antibodies.

SCFAs是腸道菌群發(fā)酵膳食纖維的終產(chǎn)物，除了為宿主提供能量，在調(diào)節(jié)免疫等方面發(fā)揮重要的作用。SCFAs的濃度主要與產(chǎn)生SCFAs的細(xì)菌豐度及飲食中膳食纖維的含量有關(guān)[13-14]。在人體中，乙酸、丙酸、丁酸占腸道中短鏈脂肪酸的95%以上。主要產(chǎn)乙酸菌包括擬桿菌類、雙歧桿菌類、消化鏈球菌類及梭菌類；主要產(chǎn)丙酸菌有擬桿菌等；主要產(chǎn)丁酸菌有梭菌、毛螺菌、真桿菌和瘤胃球菌等[15]。Su等[16]報(bào)道，Graves組患者的丙酸濃度發(fā)生顯著性改變，可能與產(chǎn)生丙酸的脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)中的YCH46分支菌群的豐度變化相關(guān)。 本研究顯示，經(jīng)過治療后的Graves組患者的丙酸及丁酸濃度仍顯著降低，同時(shí)異戊酸濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究[17]報(bào)告，擬桿菌及瘤胃球菌的代謝產(chǎn)物是丙酸及丁酸，本研究將瘤胃球菌的豐度與血清丙酸及丁酸的濃度進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，丙酸與瘤胃球菌豐度呈正相關(guān)，丙酸濃度的下降有可能跟瘤胃球菌的豐度下降相關(guān)。既往研究[18-19]表明，丁酸和丙酸能增加腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白 ZO-1 等的表達(dá),減少免疫反應(yīng)的發(fā)生,而異戊酸濃度升高會(huì)引起結(jié)腸平滑肌松弛,對(duì)腸道健康不利[20]。因此，丙酸及丁酸作為腸道菌群的代謝產(chǎn)物，其變化可能參與Graves病的免疫調(diào)節(jié)過程，這一點(diǎn)需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

TRAb抗體在Graves病的進(jìn)展及預(yù)后中發(fā)揮重要的作用。本研究表明，Graves組患者即使甲狀腺功能恢復(fù)正常，患者的腸道菌群與對(duì)照組差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一差異是否與TRAb抗體相關(guān)？本研究進(jìn)一步將血清TRAb抗體與差異腸道菌群的豐度進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果顯示，TRAb抗體滴度與瘤胃球菌豐度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。該結(jié)果提示，與甲狀腺激素濃度相比，TRAb抗體可能與Graves組患者的腸道菌群更有相關(guān)性。

綜上所述，經(jīng)過治療后的Graves病患者的腸道菌群及代謝物SCFAs發(fā)生了顯著性改變，其中擬桿菌及瘤胃球菌等菌豐度下降，代謝物丙酸及丁酸的濃度降低，丙酸濃度的下降有可能是跟瘤胃球菌的豐度下降相關(guān)。與甲狀腺激素濃度相比，TRAb抗體可能與Graves病患者的腸道菌群變化更有相關(guān)性。但在本項(xiàng)研究中，課題組未對(duì)Graves組患者治療前的腸道菌群及代謝物進(jìn)行研究，無法明確治療過程中TRAb濃度的變化與腸道菌群的關(guān)聯(lián)性。并且此研究樣本量偏小，缺乏長期隨訪跟蹤研究，未能排除藥物對(duì)腸道菌群的影響，在后續(xù)的研究中需要擴(kuò)大樣本量，對(duì)Graves組患者治療前后的腸道菌群及代謝物進(jìn)行分析，并設(shè)置藥物治療后TRAb陽性及陰性對(duì)照組，進(jìn)一步探討腸道菌群及短鏈脂肪酸與Graves病的相關(guān)性。其次，需要深入開展腸道菌群宏基因組測(cè)序分析，進(jìn)一步尋找差異菌群并進(jìn)行驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明王華：提出研究思路，設(shè)計(jì)研究方案，收集標(biāo)本及撰寫論文；史婷婷、信中：收集標(biāo)本、提取糞便DNA及采集數(shù)據(jù)；華琳：分析數(shù)據(jù)及審閱論文；李聰：整理數(shù)據(jù)；曹秋梅：總體把關(guān)，審定論文。