CDKN2A/B基因多態性在顱內動脈瘤形成過程中的功能分析

張利通 李冉 許紅旗 梁洪磊

安陽市人民醫院神經外科（河南 安陽 455000）

顱內動脈瘤（intracranial aneurysms）是多因素導致的復雜疾病，是遺傳和環境共同作用的結果。顱內動脈瘤在人群中的發病率為3.2%[1]，一旦破裂就會導致蛛網膜下腔出血，生存率低，并且伴有嚴重的后遺癥[2]。顱內動脈瘤每年的破裂率為1%，大部分顱內動脈瘤患者終身未破裂[3]。全基因組分析證實了一些基因位點與顱內動脈瘤的形成相關[4-5]。多中心研究結果重復定位在染色體9p21上的基因位點：CDKN2A/B；該基因突變與顱內動脈瘤的形成有很強的關聯性[6]，但是這些研究并沒有深入研究顱內動脈瘤形成的遺傳機制。

CDKN2A為細胞周期蛋白依賴激酶2A，CDKN2B為細胞周期蛋白依賴激酶2B，這兩個基因編碼p16INK4a（CDKN2A的外顯子1α，2和3編碼），p14ARF（CDKN2A的外顯子1β，2編碼），p15INK4a（CDKN2B編碼）。有研究表明，從鼠身上分離出血管平滑肌細胞原代培養，通過調節CDKN2A/B的表達，會引起平滑肌細胞的過度增殖或凋亡[7]。平滑肌細胞在顱內動脈瘤的發生中起著重要作用，因此這個發現很可能提示CDKN2A/B和顱內動脈瘤的形成的潛在關系。但是國內外尚沒有在動物或人體動脈瘤壁組織中探索該基因的突變在顱內動脈瘤的形成過程中的作用。因此，本文旨在探索該基因參與顱內動脈瘤的形成中的具體機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象病例組為安陽市人民醫院神經外科在2017-2021年間行開顱夾閉顱內動脈瘤的過程成功取下動脈瘤壁組織的82例患者；對照組為本院同期收治的114例入院頭CTA檢查無顱內動脈瘤的頭外傷患者。病例組：男41例，女41例，年齡（53.34±11.420）歲，高血壓42例，高血脂28例，糖尿病12例；對照組：男65例，女49例，年齡（51.17±10.519）歲，高血壓46例，高血脂38例，糖尿病10例。

1.2 方法82例離體瘤壁組織被液氮迅速冷凍，并保存于-80℃冰箱。因1例組織過小實驗中未得到相應圖片及數據，有效標本為81例。使用免疫熒光顯示瘤壁中p15INK4b/p16INK4a蛋白的表達，通過熒光染色區域的比例對比不同基因型的表達量。每個研究對象均使用EDTA抗凝管留取2 mL靜脈血標本，并提取DNA，選取CDKN2A/B相關的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms SNP）位點（rs1333040，rs700651，rs10757278，rs10757272，rs6475606）并進行基因分型，選取的SNP位點均為既往全基因組分析以及文獻中報道與顱內動脈瘤顯著相關的[5]。冰凍動脈瘤壁組織中提取RNA，使用RT-PCR技術檢測動脈瘤壁中p16INK4a，p15INK4b的表達水平，組織內 p16INK4a，p15INK4b蛋白表達量采用Western blot方法測定。每位患者均簽署知情同意書，并經過安陽市人民醫院倫理委員會審查。

1.3 統計學方法采用SPSS 25.0軟件進行統計分析，在病例組和對照組之間對每個SNP位點的等位基因頻率和基因型頻率進行統計，采用Pearson檢驗的統計方法在病例組和對照組之間比較SNP位點基因頻率之間的差異，并計算位點的相對風險度比值比（OR）及其95%CI。計量資料以（）表示，計數資料以例（%）表示。經方差齊性檢驗后（P＞0.05）采用獨立樣本t檢驗進行組間比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動脈瘤壁組織表達p15INK4b/p16INK4a蛋白預實驗通過對動脈瘤壁組織進行免疫熒光染色，可見p15INK4b/p16INK4a蛋白熒光染色，驗證動脈瘤壁組織內表達p15INK4b/p16INK4a蛋白（圖1）。

2.2 病例組和對照組的臨床特征分析兩組年齡、性別、高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙、飲酒等相關特征，結果兩組間差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1，進一步對兩組間相關SNP位點進行分析。

表1 病例組和對照組的臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of case group and control group 例（%）

2.3 SNP與顱內動脈瘤的關聯分析使用114例對照組及82例顱內動脈瘤患者外周血，提取DNA，對CDKN2A/B相關基因的SNP位點進行基因分型，在兩組間行統計學分析發現，rs10757272位點等位基因T的頻率高于對照組（P=0.029，OR=1.658，95%CI：1.051 ～ 2.614）。其余的基因位點差異無統計學意義，見表2。

表2 病例組和對照組SNP基因型和等位基因頻率Tab.2 SNP genotypes and allele frequencies in patients and controls例（%）

2.4 rs10757272位點基因型與CDKN2A/B的表達水平之間的關系在81例顱內動脈瘤壁組織中，研究rs10757272位點基因型與CDKN2A/B的表達水平之間的關系，可以觀察到該SNP位點不同基因型的p16INK4a、p15INK4bmRNA水平有差異，在T/T基因型中p16INK4amRNA低水平轉錄（P＜0.01），p15INK4mRNA也為低水平轉錄（P=0.014）。在T/T基因型中在p15INK4b蛋白為低水平表達（P=0.027），p16INK4a蛋白的表達水平差異無統計學意義（P=0.089），但是有相似的低表達趨勢（圖2）。

2.5 免疫熒光對比rs10757272位點不同基因型與p16INK4a，p15INK4b在動脈瘤壁中表達水平進一步驗證rs10757272位點不同基因型與p16INK4a，p15INK4b在動脈瘤壁中表達水平的關系，采用免疫熒光的方法標記動脈瘤壁，計算平滑肌細胞染色區域中p16INK4a，p15INK4b各自染色所占比例，結果顯示有T等位基因的SNP基因型p15INK4b低比例染色區域（P=0.037），p16INK4a差異無統計學意義（P=0.065）（圖3、4）。

推測9p21區域的相關突變SNP位點通過調節CDKN2A/B基因的表達，引起p15和p16的改變，導致細胞周期蛋白D（cyclin D）與CDK4、CDK6不能發生相互作用。cyclin D-CDK4/6復合物不能被激活，使相關蛋白不能磷酸化，進而使轉錄抑制復合物Rb-E2F不能解聚，不能釋放E2F轉錄因子，從而細胞不能增殖，并進入凋亡階段。

3 討論

全基因組和一些可重復性研究表明，位于9p21染色體上的CDKN2A/B基因位點突變是動脈瘤發生的主要因素。CDKN2A/B編碼p16INK4a和p15INK4a，分別是CDK4（細胞周期素依賴蛋白激酶4）和CDK5（細胞周期素依賴蛋白激酶5）的抑制因子，其定位于染色體9p21。其通過抑制E2F，從而抑制E2F介導的細胞增殖基因的表達，從而抑制細胞增殖，為調節細胞增殖的基因，在調節細胞周期和抑制細胞增殖方面起著重要的作用[8-10]。在純合子風險基因患者的動脈粥樣硬化板塊中分離出的平滑肌細胞提示p16和p15蛋白表達減少、細胞增殖增加；敲除大鼠9p21同源序列基因后發現主動脈平滑肌細胞中CDKN2A/B的表達減少，平滑肌細胞的增殖明顯增加，并且無法進入凋亡階段[7]。一些研究結果同樣表明，該基因通過細胞周期調節因子抑制血管壁的平滑肌細胞增殖[11-13]。但尚不清楚它們是否在人類血管系統中發揮類似的作用。

以前相關研究中均為外周血有核細胞中提取DNA研究相關位點的突變與動脈瘤的相關性[14]。但本研究為了探索相關位點的突變與動脈瘤發生的潛在機制，研究的是不同基因型顱內動脈瘤患者離體動脈瘤瘤壁中相關基因在轉錄和蛋白的合成上的差異。本文中所選SNP位點經統計分析后發現rs10757272在兩組之間差異存在統計學意義，因此，筆者認為該位點與顱內動脈瘤顯著相關。并且在國外報道中不同的人群和種族中得出相同的結論：rs10757272位點與顱內動脈瘤之間存在顯著關聯[5]。LI等[15]針對中國人群的研究中得出rs10757272與IA顯著相關；有關文獻認為該位點與冠狀動脈疾病顯著相關[16-17]。為進一步探索該SNP位點突變與顱內動脈瘤的形成的潛在機制，進一步分析rs10757272位點不同的基因型與動脈瘤壁組織內CDKN2A/B的表達水平的關系。通過檢測動脈瘤壁組織中基因表達產物p15INK4a、p16INK4a的水平，發現rs10757272位點的不同基因型與CDKN2A/B的表達水平上存在差異。尤其是本研究發現該位點TT基因型上動脈瘤壁中p15INK4a為低水平的表達，p16INK4a為低表達趨勢。rs10757272位點基因型與p15INK4a、p16INK4a的表達水平相關，在T等位基因上p15INK4a的低表達，在C等位基因上表達較高。p15INK4a/p16INK4a在不同基因型中的表達的差異，導致平滑肌細胞的塑性，平滑肌細胞的塑性在動脈血管病變中起著關鍵作用，如在動脈硬化的形成過程中扮演重要角色[18-20]。平滑肌細胞的塑性亦可導致血管壁的順應性下降，可能為動脈瘤形成的重要因素。并且在不同的基因型患者中，動脈瘤壁中的CDKN2B轉錄的mRNA有顯著的差異，并且在相應的蛋白水平上存在差異，因此本研究認為該位點的突變會引起顱內動脈血管壁平滑肌細胞結構的改變，導致動脈壁結構的變化，在外界因素的干預下導致動脈瘤的形成。

本研究以IA患者的離體動脈瘤瘤壁作為研究對象，直接探索了rs10757272位點不同基因型在瘤壁內的表達水平，但本研究結果只是初步探索SNP位點不同基因型與顱內動脈瘤之間的潛在機制，不能從動態上了解該位點參與顱內動脈瘤形成過程中的具體機制，需進一步行細胞培養，動態了解其參與顱內動脈瘤形成具體過程。