實時三維超聲心動圖聯合microRNA-499水平檢測對心力衰竭的診斷價值*

馬建英，王煒璐，解春霞，周志強

[青島市中醫醫院（青島市海慈醫院）1.心血管內科，2.功能檢查科，山東 青島266033，3.青島大學附屬心血管病醫院 心血管內科，山東 青島266071]

心力衰竭（簡稱心衰）是指因心臟無法為機體提供充足血供所致的心臟循環障礙癥候群，是諸多心血管疾病的最終轉歸[1]。心衰發生后非梗死區心肌細胞因血流動力學變化而出現病理性重構，易誘發心肌收縮功能降低、左心室重構，不及時治療可發展為泵衰竭、心律失常等不可逆性惡性事件，嚴重影響患者預后[2-3]。而以心肌細胞丟失、心肌肥厚、心肌組織纖維化等為主要特征的心室重構、心肌細胞衰亡是諸多慢性心血管疾病的主要發病機制[4]。實時三維超聲心動圖（real-time threedimensional echocardiography,RT-3DE）具有動態、操作簡便、重復性高等優勢，可直接顯示心腔立體形態，清晰反映左房容積及功能相關狀態[5-6]。有研究證實，miRNA 參與心衰、冠心病、心肌梗死等心血管疾病的發生過程[7]，但具體機制尚未完全闡明，且關于RT-3DE 聯合miRNA 用于心血管疾病診斷中的相關研究較少報道。本研究擬探討RT-3DE 聯合miR-499 水平用于心衰的診斷價值，為診治心衰、判斷預后提供臨床依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1 月—2021 年12 月就診于青島市中醫醫院的110例心衰患者作為心衰組。納入標準：①符合心衰診斷標準[8]，且經心臟彩超或胸部X射線明確病情；②美國紐約心臟病學會（New York heart association,NYHA）分級Ⅱ～Ⅳ級；③入組前6個月內心衰病情穩定。排除標準：①因瓣膜脫垂、心包疾病、發紺型先天性心臟病、瓣膜重度狹窄等所致的心衰；②3 個月內曾罹患心肌炎、心絞痛、心肌梗死、嚴重心律失常；③合并血液系統疾病、自身免疫性疾病；④嚴重肝、腎功能不全；⑤妊娠期或哺乳期；⑥惡性腫瘤。另選同期本院健康體檢者60例作為對照組，均無心腦血管疾病、免疫系統疾病、血液系統疾病、內分泌系統疾病。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 RT-3DE 檢查采用iE33 型全數字化彩色心臟超聲診斷儀（荷蘭飛利浦公司），探頭頻率1.9～3.8 MHz，取患者左側臥位，叮囑患者屏氣，將X3-1矩陣探頭置于患者心尖四腔心全容積面，開啟全容積模式，連續獲取4 個心動周期的動態圖像，調整增益、深度等參數以確保最佳圖像。使用3DQadvanced軟件與Qlab6.0 軟件對RT-3DE 參數進行定量分析，包括左室收縮末期容積（LVESV）、左室舒張末期容積（LVEDV）、左室射血分數（LVEF）、左室16 節段達到收縮末期最小容積的標準差（Tmsv16-SD%）、最大差值（Tmsv16-Dif%）。所有數據測量3 次，并取平均值。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測血清miR-499 表達采集患者治療前空腹靜脈血4 mL，置于含EDTA 抗凝劑的采血管中，室溫下靜置30 min，4℃、1 000 r/min 離心10 min，移液槍移取血清置于1.5 mL EP 管內，置于-80℃超低溫冰箱中冷藏待測。參考TRIzol 試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）說明書提取血清中總RNA，使用紫外分光光度計（美國NanoDrop 公司）測定RNA 濃度，使用逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）將總RNA逆轉錄為cDNA。通過1500 型全自動PCR 儀（美國ABI 公司）進行實時熒光定量聚合酶鏈反應擴增，反應體系總體積為20 μL，反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，58℃退火60 s，共12 個循環，采集熒光，用2-ΔΔCt法計算miR-499 相對表達量。對照組進行標準化處理。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 23.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，比較用t檢驗；計數資料以構成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關性分析用Pearson 法；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較

兩組性別、體質量指數、心率、收縮壓、舒張壓比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 兩組RT-3DE參數、血清miR-499水平比較

兩組RT-3DE 參數、血清miR-499 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），心衰組LVEDV、LVESV、Tmsv16-Dif%、Tmsv16-SD%及血清miR-499相對表達量高于對照組，LVEF低于對照組。見表3。

表3 兩組RT-3DE參數、血清miR-499相對表達量比較（）

表3 兩組RT-3DE參數、血清miR-499相對表達量比較（）

2.3 心衰患者血清miR-499 相對表達量與RT-3DE參數的相關性

Pearson 相關性分析顯示，心衰患者血清miR-499 相對表達量與LVEDV、LVESV、Tmsv16-Dif%、Tmsv16-SD%均呈正相關（r=0.373、0.347、0.228 和0.395，P=0.000、0.000、0.003 和0.003），與LVEF 呈負相關（r=-0.341，P=0.000）。見圖1～5。

圖1 血清miR-499相對表達量與LVEDV的相關性

2.4 血清miR-499相對表達量聯合RT-3DE參數診斷心衰的價值

ROC 曲線顯示，聯合診斷的AUC、敏感性、特異性最高，分別為0.932（95% CI：0.912，0.984）、0.855（95% CI：0.796，0.908）、0.832（95% CI：0.763，0.896）。見表5 和圖6、7。

圖6 LVEDV、LVESV、Tmsv16-Dif%、Tmsv16-SD%、miR-499及聯合檢測診斷心衰的ROC曲線

表5 血清miR-499表達聯合RT-3DE參數診斷心衰的診斷效能分析

圖2 血清miR-499相對表達量與LVEF的相關性

圖3 血清miR-499相對表達量與LVESV的相關性

圖4 血清miR-499相對表達量與Tmsv16-Dif%的相關性

圖5 血清miR-499相對表達量與Tmsv16-SD%的相關性

圖7 LVEF診斷心衰的ROC曲線

3 討論

正常情況下，心室壁實現心臟有效泵血的途徑在于有節律地同步性收縮、舒張。而心衰可導致心室壁收縮運動不同步、左心室收縮功能降低、心臟血流動力學改變，從而進一步對心臟攝血功能產生不利影響[9-10]。RT-3DE 集多普勒顯像技術、常規超聲心動圖、三維超聲等優點于一體，通過實時測量心動周期中某時期的體積等參數，有助于識別左心室不同步，準確評估心功能[11]。本研究中，心衰組LVEDV、LVESV、Tmsv16-Dif%、Tmsv16-SD%高于對照組，LVEF 低于對照組，與其他學者的研究結果基本一致[12]，充分證實RT-3DE 可反映心衰患者的心功能損傷情況。原因在于心衰引起的左室重構可改變心室容積、心室形態，致使左室擴大、容積增加、形態趨向球形，故LVESV、LVEDV 參數上升；而心肌質量增加，收縮力減弱，可造成LVEF 降低。但值得注意的是，雖然RT-3DE 通過測量LVEF 可對收縮性心衰嚴重程度進行定量評估，但在LVEF 正常時難以評估部分舒張性心衰患者病情[13]。

miR-499 的編碼基因位于人類20 號染色體Myh7b基因內，miR-499、Myh7b 可協同表達于心肌纖維、骨骼纖維中[14]。研究證實，miR-499 可通過活化PI3K/Akt 等諸多信號通路參與調控心肌細胞的增殖、凋亡等生理功能中[15]。SHIEH等[16]在1 項動物實驗中報道，miR-499 可通過鈍化心臟應激反應來調節心臟早期應答基因（如Fos、Egr2等）表達，miR-499 高表達可增加心臟壓力負荷，從而導致心功能障礙。以上研究提示，miR-499 表達與心肌細胞凋亡、心室重構等有關。本研究中，心衰組血清miR-499 表達高于對照組，推測血清miR-499 表達上調可能參與心衰的發生過程，推測其原因為，當心肌細胞因缺氧缺血損傷或衰亡時，細胞內miR-499 會過度釋放進入血液中，故血清miR-499 表達上升。

本研究發現，心衰患者血清miR-499 表達與LVEDV、LVESV、Tmsv16-Dif%、Tmsv16-SD%呈正相關，與LVEF 呈負相關，表明血清miR-499 表達與心衰患者心功能相關，推測原因為心衰加重心肌缺血，減弱心室心肌收縮能力與左室順應性，增加左室僵硬度，導致心肌細胞衰亡，進而造成血清miR-499 表達呈高表達。筆者認為，當檢測到患者LVEF正常，而血清miR-499 呈高表達時，可能表示患者主要存在舒張功能不全，而LVEF 降低或（和）miR-499升高，說明患者可能存在收縮功能不全或伴有舒張功能不全。ROC 曲線結果發現，RT-3DE 參數聯合miR-499 診斷心衰的AUC 為0.932，敏感性為0.855，特異性為0.832，可見聯合診斷心衰中具有較高的特異性、敏感性與準確率，miR-499 不受血脂等心血管危險因素與性別、血壓、年齡、白細胞等臨床基礎特征影響，且體外穩定性較高，與RT-3DE 參數聯合診斷時可有效彌補RT-3DE 檢查收縮功能正常時難以判斷有無心衰的缺陷。

綜上所述，心衰患者血清miR-499 呈高表達，與RT-3DE 參數密切相關，且兩者聯合對心衰有良好的診斷價值。但本研究為單中心前瞻性研究，仍存在一定不足，如樣本量少、未分析不同心功能等級心衰患者的RT-3DE 參數、血清miR-499 表達情況，且針對miR-499 參與心衰的確切機制與信號途徑尚未完全闡明，故后期需展開進一步的體內、體外或動物實驗，從蛋白、基因等不同分子水平探索miR-499 與心衰的相關性。