人臍帶間充質干細胞外泌體對大鼠骨折愈合的影響及其作用機制研究

張鶴令，景青玲，宗群川

（青海大學附屬醫院 創傷骨科，青海 西寧 810001）

骨折愈合受成骨能力、力學環境、血供等多種因素影響，愈合延遲或不愈合將嚴重影響患者肢體功能恢復及生活質量。因此，探尋促進骨折愈合的有效方式在創傷骨科備受關注[1]。間充質干細胞（mesenchymal stem cell,MSC）來源的外泌體（Exosomes,Exos）是一種由細胞分泌的細胞外囊泡，富含生長因子和細胞因子，是介導細胞間通訊，傳遞基質與癌細胞間物質的重要運輸載體，其通過轉運miRNA、mRNA、脂質及特異性蛋白，參與內環境與細胞間的信號傳遞、物質運輸，并通過調節受體細胞中相關基因的表達影響其生理行為。相較于骨髓MSC，人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSC）具有來源豐富、無倫理爭議、免疫原性低及提取方便等優勢，因而成為Exos 的主要來源之一[2-3]。有體外實驗發現，hucMSC-Exos 對小鼠成骨前體細胞的增殖與分化具有促進作用，提示其在骨折治療方面的潛能[4]。目前，有學者鑒定出多種信號通路參與成骨，其中Wnt/β-catenin 信號通路是骨穩態的關鍵調節劑，激活該通路可顯著降低骨吸收并促進骨形成，β-catenin 可通過結合核內轉錄因子改變DNA 結構，啟動下游Runt 相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）等靶向基因轉錄，促進成骨細胞增殖及分化。本研究選取小鼠前成骨細胞MC3T3-E1 制備外泌體，復制股骨干骨折大鼠模型進行體外及體內實驗，觀察hucMSCExos 對其愈合的影響，并探討Wnt/β-catenin 信號通路在該過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF 級SD 大鼠40 只，雄性，8 周齡，體重（300±20）g，購自北京安凱毅博生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2017-0006，實驗動物使用許可證號：SYXK（青）2021-0002]。本研究經醫院動物倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑hucMSC（上海雅吉生物科技有限公司），小鼠前成骨細胞MC3T3-E1（賽業生物科技有限公司），Wnt/β-catenin 信號通路抑制劑XAV939（美國MedChem Express 公司），兔抗人腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101,TSG101）、浮艦蛋白-1（Flotillin-1）、CD9、β-catenin、p-β-catenin、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β）、Runx2一抗（美國AbMART 公司）。

1.1.3 主要儀器JEM-2100Plus 透射電子顯微鏡（日本電子株式會社），數字化X 線攝片機（美國Hologic 公司），vivaCT40 型MicroCT（瑞士SCANCO Medical AG 公司），TECELF 3200 力學實驗儀器（美國Endura 公司），SZX10 顯微鏡（日本Olympus 株式會社）。

1.2 外泌體制備

hucMSC 培養于L-15 培養基中[含10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、1%雙抗]，取第3 代hucMSC，培養于高糖DMEM 培養液中（含10%FBS），待融合至75%，更換為無外泌體FBS 血清培養48 h，棄上清液，移至離心管，充分洗滌，離心棄沉淀，再次離心，4℃過夜，取沉淀即為hucMSC-Exos。取hucMSC-Exos 10 μL，滴至載樣銅網，靜置2 min，濾紙去浮液，1%磷鎢酸溶液染色5 min，透射電鏡觀察hucMSC-Exos形態。

取hucMSC-Exos 50 μL，離心棄上清液，冰上裂解，離心取上清液，移至離心管，蛋白定量試劑盒定量，加入上樣緩沖液，沸水浴變性5 min。每孔40 μg上樣，電泳轉膜，封閉2 h，加入兔抗人TSG101、Flotillin-1、CD9 一抗（1∶500），4℃孵育過夜，洗滌后加入山羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，Western blotting 檢測hucMSC-Exos 膜表面特異性標志蛋白,凝膠成像系統分析。

將成骨細胞按2×103個/孔的密度接種于96 孔板，用含體積分數為10%的FBS、1%雙抗的α-MEM培養液，在37℃，5%二氧化碳CO2條件下培育，待細胞鋪滿80%左右時胰蛋白酶消化傳代，取第3 代細胞。將細胞分為空白組、干預組，空白組用無外泌體的FBS 配置α-MEM 培養液，干預組在α-MEM 培養液中加入10 mg/L FBS 外泌體。兩組均設5 個復孔，培養箱中培養24 h、48 h 和72 h，加入新制備的0.5g/L MTT 溶液，每孔20 μL，繼續培養4 h，離心棄上清液，每孔加入DMSO溶液150 μL，振蕩10 min，繼續培養2 h，吸取上清液，用酶標儀測定490 nm 處的光密度（optical density,OD）值。

1.3 動物分組與處理

1.3.1 骨干骨折模型的復制腹腔注射麻醉大鼠，常規備皮，保持右側臥位。取右下肢股外側切口，剝離外皮，縱向切開淺層與深層筋膜層，順股外側肌間隔進行鈍性分離，暴露股骨干。在股骨中段前方最高點位置鋸缺損至骨髓腔（3 mm），形成股骨中段橫行骨折，沿髓腔插入克氏針直到貫穿整個股骨髓腔，固定骨折，剪除多余克氏針，將遠端埋在骨皮質下。常規縫合、抗感染。術后即刻拍攝X射線片，以股骨中段斜形或橫形骨折，骨折端內固定效果理想，未發生明顯移位為骨干骨折模型復制成功[5]。

1.3.2 干預方法40 只大鼠復制股骨干骨折模型，成功30只，隨機分為對照組、外泌體組、復合組，各10 只。將水凝膠作為hucMSC-Exos 的載體，hucMSCExos 100 μg 溶于PBS 緩沖液50 μL 中。骨折后7 d，對照組經皮從骨折斷端注射PBS 緩沖液50 μL、水凝 膠100 μL 至骨髓腔，cMSC-Exos 組同法注射hucMSC-Exos 100 μg、水凝膠100 μL 至骨髓腔[6]。復合組同法注射hucMSC-Exos 100μg、水凝膠100 μL至骨髓腔，腹腔注射Wnt/β-catenin 信號通路抑制劑XAV939 DMSO 溶液5 mL（XAV939 劑量為1 mg/只）[7]。對照組、外泌體組腹腔注射DMSO溶液5 mL。

1.4 MicroCT掃描

干預后2周、4周行MicroCT掃描。采用CTAn軟件定量分析，計算骨小梁數量（trabecular number,Tb.N）及骨體積分數（bone volume/total volume,BV/TV）。

1.5 生物力學測試

末次MicroCT 掃描后，頸椎脫臼處死大鼠，剝離左下肢股骨，骨水泥固定兩端，采用力學實驗儀器行四點彎曲實驗，記錄最大載荷、最大載荷恢復率。

1.6 蘇木精-伊紅染色觀察大鼠骨痂組織病理變化及組織學評分

處死大鼠后，取骨折上下各5 mm×5 mm 骨痂組織，行常規蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染色，光鏡下觀察骨折愈合情況。組織學評分標準：0 分，骨折兩端界限清晰，無骨膜反應；1 分，骨折兩端界限明顯，輕度骨膜反應；2 分，骨折兩端界限模糊，可觀察到少量骨痂；3 分，骨折兩端界限接近于消失，可觀察到大量骨痂；4 分，骨折兩端無界限，骨痂填滿。

1.7 Western blotting 檢測大鼠骨痂組織βcatenin、p-β-catenin、GSK-3β、Runx2蛋白的表達

取骨折位置骨痂組織40 mg，加入生理鹽水充分研磨勻漿，RIPA 裂解，4℃離心，取上清液，定量蛋白，取微量蛋白樣本，混合4 倍體積上樣緩沖液，加熱變性蛋白，離心取上清液，行凝膠電泳分離，濕法轉膜，5% 脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗大鼠βcatenin、p-β-catenin、GSK-3β、Runx2 一抗（1∶500），低溫搖床過夜，加入二抗（1∶2 000）常溫孵育2 h，洗膜后經ECL 發光、暗室顯影，以GAPDH為內參，凝膠成像系統分析。

1.8 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外泌體鑒定結果

透射電鏡觀察顯示，Exos 大小、分布不均，表現為類圓形或圓形環狀結構，具有雙圓盤結構囊泡，直徑30～200 nm，符合Exos 特征。Western blotting 結果顯示，與全細胞蛋白裂解物比較，獲取的hucMSCExos 膜表面富含特異性標志蛋白TSG101、Flotillin-1、CD9。見圖1、2。

圖1 hucMSC-Exos形態（透射電鏡×70 000）

圖2 hucMSC-Exos膜表面特異性標志蛋白的表達

2.2 3組大鼠不同時間點Tb.N、BV/TV的變化

對照組、外泌體組、復合組大鼠干預后2 周、4 周的Tb.N、BV/TV 比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點Tb.N、BV/TV 有差異（F=23.584 和31.267，均P=0.000）；②3 組大鼠Tb.N、BV/TV 有差異（F=85.512 和54.796，均P=0.000），與對照組、復合組相比，外泌體組Tb.N 較多，BV/TV 較高，促進骨折愈合效果相對較好；③3 組大鼠Tb.N、BV/TV 變化趨勢有差 異（F=19.417 和25.461，均P=0.000），見表1。

表1 3組大鼠不同時間點Tb.N、BV/TV比較（n=10，）

表1 3組大鼠不同時間點Tb.N、BV/TV比較（n=10，）

2.3 3組大鼠最大載荷、最大載荷恢復率比較

對照組、外泌體組、復合組大鼠最大載荷、最大載荷恢復率比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）；外泌體組最大載荷、最大載荷恢復率高于對照組和復合組。見表2。

表2 3組大鼠最大載荷、最大載荷恢復率比較（n=10，）

表2 3組大鼠最大載荷、最大載荷恢復率比較（n=10，）

2.4 大鼠骨痂組織病理變化及組織學評分比較

對照組骨小梁不具明顯的方向性，成骨不活躍，骨小梁增粗不明顯；外泌體組骨折斷端可觀察到較多的骨性骨痂，骨小梁部分成熟，且有明顯礦化，且與應力方向一致，排列有序；復合組可觀察到生成較多軟骨性及纖維性骨痂，在軟骨性骨痂邊緣有較多鈣化，有骨外膜下成骨，并形成骨小梁，間隙中毛細血管豐富。見圖3。

圖3 3組大鼠骨痂組織病理切片（HE染色×40）

對照組、外泌體組、復合組大鼠骨痂組織組織學評分分別為（1.68±0.37）分、（2.47±0.52）分、（3.08±0.63）分，經方差分析，差異有統計學意義（F=18.380，P=0.000）；與外泌體組比較，對照組組織學評分降低（P＜0.05），復合組組織學評分升高（P＜0.05）。

2.5 3 組大鼠骨痂組織p-β-catenin/β-catenin、GSK-3β、Runx2蛋白相對表達量比較

對照組、外泌體組、復合組大鼠骨痂組織p-βcatenin/β-catenin、GSK-3β、Runx2 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，外泌體組pβ-catenin/β-catenin、Runx2蛋白相對表達量升高（P＜0.05），GSK-3β 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與外泌體組比較，復合組p-β-catenin/β-catenin、Runx2 蛋白相對表達量降低（P＜0.05），GSK-3β 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見表3。

表3 3組大鼠骨痂組織p-β-catenin/β-catenin、GSK-3β、Runx2蛋白相對表達量比較（n=10，）

表3 3組大鼠骨痂組織p-β-catenin/β-catenin、GSK-3β、Runx2蛋白相對表達量比較（n=10，）

3 討論

股骨干骨折是臨床常見的成人骨折類型，盡管骨組織擁有很強的愈合力，但仍有10%左右的患者存在股骨干骨折延遲愈合或不愈合問題，進而導致骨骼畸形、肢體縮短、永久性殘疾等并發癥[8]。隨著組織工程技術的不斷進步，以hucMSC 移植為代表的細胞移植成為治療骨折的新型方式。然而有研究發現，外源性hucMSC 移植后并未直接參與損傷組織的修復、再生過程，而是通過旁分泌效應如分泌Exos 參與組織修復[9-10]。

Exos 是直徑30～150 nm 的囊泡樣小體，觸發適應性及先天性免疫應答風險小，無致瘤性，且具有性質穩定、可長期存儲的優勢，其與干細胞功能類似，在心血管疾病、骨科疾病、神經系統疾病及肝病等領域均取得了較大成就[11-13]。hucMSC-Exos 注入骨髓腔周可釋放促軟骨細胞增殖及促基質合成因子，可調節微環境平衡，促進軟骨修復與再生[14]。此外，hucMSC-Exos 中含有豐富的酶類，可改善生物能量代謝、調節細胞數量，并通過調控免疫系統恢復細胞內穩定結構[15]。ZHANG等[16]研究表明，Exos 作為細胞間通訊的重要參與者，通過促進骨生成和血管生成，對骨不連的治療發揮關鍵作用。LIANG等[17]研究證實，骨髓MSC 外泌體可促進軟骨細胞穩態重建，減少軟骨細胞凋亡，并減少炎癥組織中巨噬細胞聚集，下調炎癥因子水平達到抗炎效果。本研究結果顯示，與對照組比較，外泌體組干預后2 周、4 周Tb.N 增加，BV/TV、最大載荷、最大載荷恢復率升高，提示hucMSC-Exos 可促進股骨干骨折大鼠骨折愈合，并提高骨痂生物力學性能。

Wnt/β-catenin 信號通路是調控細胞生長及分化的經典途徑，與骨生成代謝關系密切，在該通路中β-catenin 是具有正向調節作用的核心蛋白，GSK-3β是其負向調控酶，可促進β-catenin 磷酸化，p-βcatenin 與DNA 親和蛋白結合形成復合體，從而調控下游靶基因，參與骨代謝過程[18-19]。近年來，以Wnt/β-catenin 信號通路為靶點，治療骨折的體內動物實驗研究已獲得一定進展[20-22]。LIU等[23]研究發現，激活Wnt/β-catenin 信號通路可促進成年和老年雄性小鼠干骺端骨折愈合，其骨痂組織中成骨細胞數量增加，且活性亦隨之增強。此外有學者發現，激活Wnt/β-catenin 信號通路可通過誘導血管生成和細胞分化，促進小鼠骨折愈合，提示該通路在成骨分化及骨形成中發揮重要作用[24]。本研究結果顯示，與對照組比較，外泌體組骨痂組織p-β-catenin/βcatenin、Runx2 蛋白相對表達量升高，GSK-3β 蛋白相對表達量降低，且在hucMSC-Exos 的基礎上增加Wnt/β-catenin 信號通路抑制 劑XAV939將減弱hucMSC-Exos 對骨折愈合的促進作用，提示Wnt/βcatenin 信號通路在骨折大鼠中活性降低，hucMSCExos 可能通過激活Wnt/β-catenin 信號通路發揮作用。

綜上所述，股骨干骨折大鼠骨髓腔內注射hucMSC-Exos 對骨折愈合具有促進作用，其作用機制可能與激活Wnt/β-catenin 信號通路有關。